Введение к работе
Актуальность проблемы. Установление аминокислотной последовательности белков без их выделения на основании данных о структуре генов стало одной из быстро развивающихся областей биохимии и молекулярной биологии. Благодаря быстроте такого анализа, получен обширный материал о сходстве и различиях в первичной структуре одноименных белков различного происхождения, выявлены консервативные и вариабельные участки в пределах отдельных доменов, установлено, что функционатьно - гомологичные белки образуют семейства и суперсемейства, подразделяющиеся по степени сходства аминокислотных последовательностей на дискретные группы - классы, подсемейства. Накопление подобной информации имеет большое теоретическое и практическое значение, поскольку позволяет установить филогенетические связи внутри семейств, направление и тенденции эволюционных изменений генов животных, растений и бактерий и их продуктов, таким образом, имеет отношение к проблеме эволюции отдельной белковой функции, а также выясняются взаимосвязи структуры и функции. Участие в целом ряде ключевых, метаболических путей и недостаточность информации о семействе NAD(P)+ - зависимых альдегиддегидрогеназ (ALDH) высших растений, катализирующих окисление широкого спектра эндогенной или экзогенной природы алифатических и ароматических альдегидов до соответствующих кислот, делают их исследование с помощью такого подхода актуальным.
Найдено участие бетаиновой альдегиддегидрогеназы (К.Ф.1.2.1.8) в биосинтезе глицинбетаина - осмолита, обеспечивающего устойчивость ряда растений к условиям нехватки влаги, засоленности [Rhodes, Hanson, 1993; Wood et al., 1996] и, возможно, к воздействию холода [Kishitani et al„ 1994]. Предполагается участие митохондриальной альдегиддегидрогеназы высших растений (К.Ф.1.2.1.3) в биосинтезе индолилуксусной кислоты - фитогормона ауксина [Asker, Davies, 1985], в биосинтезе глицина [Davies, 1960; Asker, Davies, 1985], в детоксикации вредных альдегидов, возникающих, например, при заболеваниях растений [Cui, 1996].
Степень изученности альдегиддегидрогеназ высших растений мала по сравнению с таковыми млекопитающих и человека. Информация о
них представлена несколькими неполными физико-химическими характеристиками, полученными при исследовании частично очищенных белков [Davies, 1960; Wightman, Cohen, 1968; Takeuchi, Uritani, 1981; Asker, Davies, 1985]. Информации по полной структуре ни одного из их генов нет. Есть только сведения по клонированию кДНК BADH шпината, сахарной свеклы, ячменя и сорго [Rhodes, Hanson, 1993 ; Wood et al., 1996], кДНК нефосфорилирующих глицеральдегид-3-фосфатдегидро-геназ гороха и маиса [Habenicht et al., 1994] и кДНК белка RF2 кукурузы, подобного митохондриальной альдегиддегидрогеназе млекопитающих со степенью гомологии около 60% [Cui et al., 1996].
Настоящая работа посвящена выявлению в геноме представителя семейства бобовых - маш Vigna radiata (англ. назв. mung bean) генов семейства альдегиддегидрогеназ. В ней также отражен этап подготовки к клонированию гена митохондриальной альдегиддегидрогеназы Vigna radiata.
Цели и задачи исследования. Основными целями предлагаемой работы были поиск и идентификация в геноме Vigna radiata протяженных фрагментов генов семейства альдегиддегидрогеназ. В рамках подготовительного этапа к клонированию гена митохондриальной альдегиддегидрогеназы Vigna radiata была поставлена цель, заключающаяся в выделении высокоочишенной 54 - кДа субъединицы митохондриальной альдегиддегидрогеназы и получении антител к ней. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
Поиск протяженных фрагментов генов альдегиддегидрогеназ Vigna radiata на тотальной ДНК с помощью праймеров, созданных на основе анализа участков консервативности известных генов альдегиддегидрогеназ, и метода полимеразной цепной реакции.
-
Клонирование, секвенирование протяженных фрагментов генов альдегиддегидрогеназ Vigna radiata. Сравнительный анализ нуклео-тидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей этих фрагментов с последовательностями известных генов альдегиддегидрогеназ и их белковых продуктов.
-
Выделение и характеристика высокоочишенной 54 - кДа субъединицы митохондриальной альдегиддегидрогеназы корней Vigna radiata. Получение поликлональных моноспецифических антител, необходимых для клонирования ее гена.
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе представлены новые данные о получении из генома Vigna radiata
протяженного (651 п. н.) фрагмента гена, кодирующего частичную последовательность неописанной ранее альдегиддегидрогеназы высших растений. Получение этих данных имеет фундаментальное значение. Этот фрагмент может служить специфическим зондом для поиска полноразмерного гена неизвестной ранее альдегиддегидрогеназы, исследование которого расширит представление о семействе генов альдегиддегидрогеназ высших растений и кодируемых ими белках. Получение белкового продукта этого гена и познание энзиматических свойств дадут возможность найти подходы к исследованию его непознанной функции.
Получены поликлональные моноспецифические антитела к высокоочищенной 54 - кДа субъединице митохондриальной альдегиддегидрогеназы Vigna radiata с высокой антигенсвязывающей активностью, позволяющей их использовать в качестве зонда для клонирования ее гена. Сочетание данных о свойствах белкового продукта и его гена облегчит поиск неизвестной функциональной роли фермента.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных семинарах биохимического отдела и заседаниях Ученого совета Якутского института биологии СО РАН и на 8-м Международном симпозиуме «Энзимология и молекулярная биология карбонильного метаболизма» (Дейдвудд, США, 1996)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 151 странице машинописного текста, включая 22 рисунка и 11 таблиц, список литературы включает 157 работ.