Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспрессионных плазмидных векторах Escherichia coli, и анализ продуктов экспрессии Рунова, Ольга Леонидовна

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Рунова, Ольга Леонидовна. Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспрессионных плазмидных векторах Escherichia coli, и анализ продуктов экспрессии : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.04.- Санкт-Петербург, 1999.- 108 с.: ил. РГБ ОД, 61 02-3/676-3

Введение к работе

Актуальность проблемы,

Изучение структурно-функциональных отношений а мультияоменных белках клеточной поверхности, функционирующих как рецепторы специфических белковых или иных лигаидов и участвующих либо в переносе веществ между клетками и внеклеточными пространствами, либо в передаче сигналов от внеклеточных лигандов, является одной из центральных проблем современной молекулярной медицины. Среди рецепторов, интернализирующих связанные лиганды, наиболее изучен рецептор липопротеинов низкой плотности (РЛНП). Прогресс в исследовании РЛНП связан прежде всего с классическими работами Голдштейна и Брауна (Brown, Goldstein, 1976, 1986; Goldstein, Brown, 1989), которые впервые описали РЛНП и показали, что одно из наиболее распространенных аутосомно-доиинантных заболеваний человека - семейная гиперхолесгеринемия обусловлена мутациями в гене РЛНП с гетерогенными биохимическими проявлениями (количественный дефицит РЛНП, нарушение его лиганд-связывающей активности, блоки интерналиаации комплекса РЛНП-лиганд и реутилизации РЛНП с его возвращением на поверхность клетки). В дальнейшеи эти авторы и их сотрудники (Yamamoto et al., 1984) осуществили клонирование кДНК, кодирующей РЛНП, определили ее нукяеотидную последовательность и исследовали экзошшо-шггронную структуру гена РЛНП, На основании этих данных в разных странах, в том числе, в России, проведено изучение нарушений структуры мутантных аллелей гена РЛНП у больных с семейной гиперхолесгеринсмией (Мандельштам и др., 1995а^б; Chakir et al., 1998; Mandelshtam et al., 1998), которое продемонстрировало множественность и гетерогенность этих мутаций (к настоящему времени описано более 300 мутаций гена РЛНП (Hobbs et al., 1992; Varret et al., 1997), в России - 8 мутаций). В то же время все представления о пространственной и мультидоменной структуре РЛНП основаны лишь на предсказаниях, базирующихся на сведениях об аминокислотной последовательности этого белка, и лишь в последние годы появились сообщения о прямом анализе трехмерных структур относительно коротких фрагментов РЛНП (цистенн-богатых повторов внеклеточного доиена), изолированных в виде рекомбинантных белков - продуктов экспрессии соответствующих плаэмид в клетках Escherichia colt (Bieri et al., 1995; Daly et al., 1995a,6, Blaoklow, Kim, 1996, Fass et al, 1997). В связи с этим мы предприняли попытку получить рекомбинантный белок со структурой и активностью полноразмерного лигавд-связывающего домена РЛНП человека. Актуальность этой темы исследования обусловлена следующими соображениями: 1) для оценки общей функциональной активности РЛНП необходимы сведения о трехмерной структуре полноразмерного лиганд-связывающего домена; 2) наличие индивидуального белка - лиганд-связывающего домена РЛНП имеет

существенное~значение для выяснения функциональных^следствий мутационных аминокислотных замен и делеций в этой домене; 3) на основерскомбинаигного -лнганд-связывающего домена РЛШ1 может быть создана простая бесклеточная тест-система для изучения струетурных аномалий ЛНП-частиц и их белковых компонентов, нарушающих их связывание с РЛНП, 4) липшд-связывающий домен РЛНП в перспективе может найти применение в качестве специфического твердофазного сорбента для элиминации ЛШ1 из крови больных с различными формами гиперхолестеринемин. Наряду с этими конкретными направлениями использования лиганд-связывающего домена РЛНП в научных исследованиях и в практической медицине, его получение в виде рекомбинантного белка должно способствовать решению общей проблемы так называемых растворимых рецепторов, представляющих собой внеклеточные (как правило, N-концевые) фрагменты мембранных рецепторов и функционирующих как антагонисты мембранных рецепторов, которые конкурируют с ними за высокоаффинное связывание лигандов (Tomida et al, 1994, Han et ai., 1994). Механизмы образования таких растворимых рецепторов in vivo могут быть разнообразными (ограниченный протеолиз со "слущиванием" внеклеточных фрагментов рецептора в среду, инициация транскрипции с альтернативных промоторов, альтернативный сплайсинг пре-мРНК, сдвиги рамки считывания с ранней термннацией, экспрессия неаллельных генов, кодирующих растворимые рецепторы и др.), Рекомбинантные лиганд-связывающие домены различных поверхностных рецепторов используются для анализа структурной организации комплексов рецептор-лиганд. В отдельных работах показано, что в среде культивирования клеток и в биологических жидкостях человека содержится белок, соответствующий по размерам и по последовательности аминокислот лиганд-связывающему доиену РЛНП и обладающий антивкрусной активностью (Fischer et al., 1993), В связи о этими соображениями получение в препаративных количествах рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП человека должно способствовать как дальнейшему исследованию природного растворимого РЛНЛ, так и созданию высокоснецифическнх способов модулирования активности мембранного РЛНП в культурах клеток и в многоклеточном организме,

Цели и задачи исследования.

Основной целью работы было конструирование векторных плазмид, кодирующих лиганд-связывающий домен РЛНП и изучение его иммунохимичсской специфичности и функциональной активности. Дня достижения этой цели были поставлены следующие этапные задачи исследования:

  1. Конструирование экспрессиошшх плазиид, кодирующих лиганд-связывающнй домен РЛНП, на основе векторов серий рШХ и рЕТ и плазмиды pLDLR-3, содержащей полноразмерную кДНК РЛНП.

  2. Оптимизация экспрессии этих рекомбинантных ДНК в бактериальных клетках.

  3. Разработка процедур выделения рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП в виде гомогенного белка.

  4. Получение антител к рекомбинаптным белкам и изучение их специфичности и перекрестных взаимодействий с РЛНП клеток человека.

  5. Оптимизация процедур воссгановления-денатурацни и рефолдинга для получения функционально активного рекомбинантного белка, обладающего ЛНГІ-

- связывающей активностью.

Научная новизна работы.

Впервые выделен и охарактеризован полноразмериый лиганд-связывающий домен РЛН11 человека - продукт экспрессии соответствующего фрагмента кДНК РЛНП в плазмидных векторах Е. colt. Разработаны лрепаративные методы выделения этого белка в гомогенном виде. В результате процедур восстановления-денатурации и последующего рефолдинга рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП достигнуто реконструирование его специфической кальций-зависимой ЛНП-связывающей активности,

Практическая значимость работы.

Полученные антитела к рекомбинантноиу лиганд-связывающему домену РЛНП перекрестно реагаруют с природным РЛНП. клеток человека и могут использоваться для его иммунохимичсской детекции в реакции иммуноблотинга и количественного определения. Лиганд-связывающий домен РЛЛП, обладающий специфической ЛНП-свяэывающей активностью, в перспективе может нантн применение для создания тест-системы определения аномальных ЛШ1 в крови человека и для специфической элиминации ЛНП из крови больных с различными формами гиперхолестеринемии.

Основиые положения, выносимые на защиту:

  1. Сконструированы плазмидные экспрессионные векторы, направляющие 8ыоокоэффективный синтез рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП человека в клетках Escherichia coli.

  2. Рекомбинантный лиганд-связывающий домен РЛНП препаративно выделен в виде электрофорегически гомогенного белка.

  3. Получены антитела к двум формам этого рекомбинантного белка (слитого с 3-галактозидазой и индивидуального), дающие перекрестную иммунологическую реакцию с природным РЛНП мембран клеток человека.

4, Для получения функционального активного рекомбинантного

домена РЛШІ, синтезируемого в клетках Escherichia coli, необходимо его восстановление, денатурация и последующий рефолдииг tr/тем медленного диализа против кальций-содержащих буферных растворов. При этом происходит реконструкция специфической кальций-зависимой ЛНП-связывающей активности, первоначально не определяемой дай исходного рекомбинантного белка. Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на конференции молодых физиологов и биохимиков России, Санкт-Петербург, 1995 г,; на симпозиуме, посвященном 110-летию со дня рождения академика Н.Н.Аннчкова, 21-23 ноября 1995 г., Санкт-Петербург; на Втором Съезде Биохимического общества Российской Академии Наук, Москва, 19-23 мая 1997 г., на 1-ой медико-биологической конференции молодых ученых Санкт-Петербурга, 17-19 ноября 1997 г.; на международном симпозиуме "Protein Structure, Stability and Folding. Fundamental and Medical Aspects", Москва, 22-26 июня 1998 г.; на конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", посвященной 240-летию ММА им. ИМСеченова, Москва, 1998 г.; на международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", 21-25 сентября 1998 г., Пущине Основные положения работы отражены в материалах этих конференций и в двух журнальных статьях.

Структура диссертации. ' Диссертация изложена на^траннцах и содержит; введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов и выводы. Работа иллюстрирована ^рисункаии. Список литературы содержет вазваний работ на русском и английском языках.