Введение к работе
Актуальность проблемы. Гликопротеииы (ГП) принадлежат к числу широко распространенных в организме человека и животных соединений. Они участвуют в построении клеточных и субклеточных мембран, образуют основу гликокаликса и слизистых секретов; к ним относятся многие ферменты и гормоны [Хьюз Р, 1985; Biol М. et al., 1987; Тутельян В.А.,1992]. ГП играют особую роль в процессах клеточного узнавания и межклеточного взаимодействия, в свою очередь лежащих в основе таких ключевых биологических процессов, как клеточная пролиферация и дифференцировка, органогенез, иммунный ответ. Изменениям ГП клеточных поверхностей приписывают важную роль в процессах канцерогенеза [Sharon N., 1981,1995; Shauer R.,1995]. Значительный интерес представляет проблема влияния на строение и метаболизм ГП алиментарных факторов, в том числе таких, как белки [Wood N. et al., 1980], углеводы [Tepperman Н.М. et al.,1981;Biol М.С. et al.,1981], жирорастворимые витамины [De Luca L., 1984,1991; Wolf G., 1984; Спиричев В.Б., Конь И.Я.,1989], микроэлементы [Philip В. et al., 1978].
Участие ГП в реализации многих биологически важных функций и изменение их метаболизма при ряде патологических состояний предопределяет значительный интерес исследователей к изучению различных аспектов проблемы ГП, выделившейся в последние годы в самостоятельный раздел биохимии - гликобиологию [Sharon N., 1981,1995; Shauer R.,1995; Dwek R. and Quiocho F„ 1991; Габриэлян Н.Д.,1989,1995]. Важное место при этом занимает вопрос о структуре и функции олигосахаридных цепей ГП, которым приписывают участие в определении таких важных физико-химических свойств ГП, как поверхностный заряд их молекул, особенности конформации, растворимость, а также в защите ГП от неконтролируемого протеолиза и ошибочного процессинга, их внутриклеточном транспорте и др.[ОЫеп К. et al.,1985; Biol М. et al., 1987; Enns С. et al., 1995] Однако, функциональная роль гликановых цепей остается мало изученной, и в значительной мере сводится к представлению о том, что десиалирование ГП ведет к их захвату специфическими асиало-ГП-рецепторами печени и удалению из кровотока [Ashwell С, 1974; GregoriadisG.,1984]. Установлено также, что при остром воспалении увеличение в крови общего содержания белков острой фазы сопряжено со снижением степени их гликозилирования [Raynes J., 1982]. Изменения степени гликозилирования ГП крови обнаружены и при таких патологических состояниях, как алкогольный цирроз печени [Jezequel М. et al., 1988], ревматоидный артрит [Raynes J., 1982], онкологические заболевания [Новикова Л.И., Алешкин В.А.,1991]. Однако, причины и возможное
функциональное значение выявленных изменений степени гликозилирования ГП крови остаются практически неизученными.
Исходя из изложенного, представляет значительный интерес оценка возможных нарушений степени гликозилирования ГП крови при некоторых физиологических и патологических состояниях у человека, связанных с изменением скорости роста и клеточной дифференцировки (беременность; гипотрофия и недоношенность у детей), а также в экспериментах на животных, сопряженных с нарушением синтеза белков и, в том числе, ГП в печени - основном органе синтеза сывороточных ГП (интоксикация бромбензолом, радиационное поражение).
Изучение ГП крови представляется особенно актуальным с учетом таких важных и разнообразных функций, которые выполняют эти биомолекулы, как участие в свертывании крови, ингибировании активности протеаз, транспорте липидов, витаминов, гормонов, металлов, лекарственных веществ и т.д.[Кухта В.К. и др., 1986; Biol М. et al., 1987), и значительных изменений в их содержании и строении при ряде патологических состояний (инфекции, наследственные энзимопатии, аллергические реакции [Martinez J., 1987; Tun J. et al.,1995; Марокко И.Н., 1989].
Среди различных ГП крови важное место занимают трансферрин и орозомукоид (оц -кислый ГП). Трансферрин играет центральную роль в транспорте железа в организме, осуществляя перенос ионов железа от участков их адсорбции в желудочно-кишечном тракте к местам депонирования (печень, костный мозг и другие кроветворные органы) и утилизации (различные периферические ткани организма) [van Eijk H.G.,De Jong G. et al., 1990, 1992]. Вместе с тем, он обладает значительной рост-стимулирующей и антиоксидантной активностью [Gutteridge J.M.C.,1986; McCarthy В.М. et al.,1987; Djeha A. et al.,1993; Hamlin G.P. et al.,1995]. Орозомукоид, относящийся к числу белков острой фазы, проявляет выраженные иммуномодулирующие свойства[Веппе!1 М. et al., 1980; Cheresh D.A., 1984; Shiyan S.D. et al.,1995]. Гликановые цепи, входящие в состав обоих белков, составляют существенный и значимый структурный компонент этих ГП. Однако, их роль в реализации функций транеферрина иаі- кислого ГП остается практически не исследованной и требует дальнейшего изучения в качестве одного из подходов к расшифровке механизмов биологической активности этих функционально важных белков крови.
Цель и задачи исследования. Цель работы: 1) исследовать степень гликозилирования суммарных ГП сыворотки крови, а также транеферрина и осі - кислого ГП при некоторых физиологических и патологических состояниях, связанных с изменением скорости роста и клеточной дифференцировки у человека, а также патологических состояниях,
сопровождающихся нарушением синтеза белка в печени, у экспериментальных животных; 2) изучить возможное функциональное значение степени гликозилирования ГП. Исходя из этого были поставлены следующие задачи:
1. Изучить содержание и степень гликозилирования суммарных ГП сыворотки крови
при беременности - физиологическом состоянии, характеризующемся перестройкой
иммунной системы матери в ответ на пролиферацию и дифференцировку тканей плода; а
также при недоношенности и гипотрофии у детей первых месяцев жизни - патологических
состояниях, отражающих, соответственно, физиологическую незрелость и нарушения
роста вследствие недостаточного питания.
2. Разработать электрофоретический метод, позволяющий корректно судить о
содержании и степени гликозилирования трансферрина сыворотки крови.
-
Изучить влияние указанных состояний на содержание в крови и гликозилирование трансферрина и орозомукоида.
-
Изучить содержание трансферрина сыворотки крови и степень его гликозилирования в экспериментальных условиях, моделирующих токсическое (интоксикация бромбензолом) и радиационное поражение белок-синтезирующих систем печени.
5. Выделить препараты трансферрина, обладающие различной степенью сиалирования, и изучить их влияние на антиоксидантную активность и рост-стимулирующую функцию этого ГП в модельных системах in vitro (клетки костного мозга и желточные липопротеины).
Научная новизна работы.
Доказано наличие прямой корреляции между сроком беременности и содержанием в крови фракции орозомукоида, не реагирующей с конканавалином А.
Впервые показано, что у детей первых месяцев жизни с гипотрофией и недоношенных новорожденных увеличивается степень гликозилирования трансферрина по сравнению со здоровыми новорожденными.
Получены приоритетные данные о снижении гликозилирования трансферрина в позднем пострадиационном периоде и уменьшении степени гликозилирования трансферрина на фоне резкого увеличения его общего содержания под влиянием цинк-металлотионеина у мышей.
Впервые установлено, что рост-стимулирующая и антиоксидантная активность трансферрина in vitro зависит от степени его сиалирования.
На основании проведенных клинико-биохимических и экспериментальных исследований выдвинуто положение об изменении степени гликозилирования ГП сыворотки крови при ряде физиологических и патологических состояний у человека и животных (беременность;
недоношенность и гипотрофия, радиационное поражение) и относительной независимости регуляции метаболизма полипептидных и гликановых цепей ГП.
Научно-практическая значимость.
Полученные в работе данные о нарушении уровня белков и гликозилирования ГП сыворотки крови у недоношенных детей и детей с гипотрофией способствуют раскрытию механизмов патогенеза данных состояний и разработке методов их коррекции, в том числе диетической. Изучение степени гликозилирования ГП сыворотки крови может быть использовано для разработки дополнительного диагностического и прогностического теста при оценке тяжести лучевой болезни, а также гипотрофии и недоношенности у детей.
Основные положения диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре медицинской химии с курсом клинической биохимии ММСИ. Разработан количественный электрофоретический метод определения содержания и степени гликозилирования ТФ сыворотки крови, который может найти применение в клинико-диагностической практике. Получено удостоверение на рационализаторское предложение"Количественная оценка электрофореграмм, полученных после электрофореза в полиакриламидном геле" № 37/87-6 .
Обнаруженные в работе особенности антиоксидантного действия трансферрина с различной степенью сиалирования способствуют пониманию механизмов влияния трансферрина на перекисное окисление липидов.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Всероссийской конференции "Действие ионизирующей радиации на иммунную и кроветворную системы"(Москва, ноябрь 1995), на межлабораторной конференции НИИ питания РАМН и на семинаре лаборатории химии углеводов НИИ биоорганической химии РАН.
Публикации. Материалы исследований изложены в 6 печатных работах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей изложение методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего источников. Работа изложена на страницах и включает таблиц и рисунков.