Кинетика обратимой Mg2+-АДФ-зависимой инактивации CF1-АТФазы хлоропластов Вицева, Ольга Ивановна

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Одним из центральных вопросов биоэнергетики является вопрос о ме-:анизме преобразования и запасания энергии в биологических системах. В фоцессе фотосинтеза энергия света накапливается в виде химических соеди-іений с высоким энергетическим потенциалом, таких как НАДФН и АТФ. апасенная в этих продуктах энергия обеспечивает в конечном счете все нергозависимые процессы, включающие биосинтетические реакции, актив-ый транспорт ионов, ассимиляцию СОг в темновых стадиях цикла Кальви-а. В хлоропластах, а также в митохондриях и в бактериях, синтез/гидролиз Л"Ф, сопряженный с трансмембранньш переносом протонов, осуществляет-\ АТФ-синтазой (Н⁺-АТФаза, CFoCFi), которая является ключевым фер-ентом энергетического метаболизма в биологических системах (Mitchell, >74; Скулачев, 1974). АТФ-синтазный комплекс состоит из водораствори-ого сопрягающего фактора CFi, осуществляющего ферментативный ката-13, и мембранного сектора, CFo, выполняющего функцию протонного каша. Сложная субъединичная организация АТФ-синтазного комплекса, спорность его к модуляции каталитической активности в зависимости от іешних и внутренних факторов, предполагает наличие сложной системы [догенной регуляции процессов синтеза/гидролиза АТФ. Одним из путей ергозависимой регуляции Н⁺-АТФазы является М²⁺-АДФ-зависимое ин-бирование фермента, которое связано с образованием неактивного Mg-ЦФ комплекса с каталитической частью фермента (CFi) и проявляется при энергнзации тилакоидной мембраны. При энергизации мембраны наблю-ется обратный процесс реактивации Н⁺-АТФазы, сопряженный с диссо-ацией прочно связанного АДФ (Воуег et all., 1976; Strotmann et all., 1976). ітя механизму ингибирования фермента при участии Mg²⁺ и АДФ посвя-ио значительное количество работ, ряд важных аспектов этого механизма гаются неясными. В частности, недостаточно изучены свойства центров, ізьівающих АДФ и ионы магния, ответственных за ингибирование фер-ита. Не рассматривалась возможность участия в процессе ингибирования *тих нуклеотидсвязывающих центров Н⁺-АТФазы. Остается открытым ірос об участии минорных субъединиц фермента в М²⁺-АДФ-зависимом -ибировании. Одним из важных методических подходов к изучению меха-:ма функционирования АТФ-синтазного комплекса был и остается метод (етического анализа. Такой анализ представлялось целесообразным продать на изолированном сопрягающем факторе хлоропластов CFi , кото-i является простым объектом, сохраняющим способность к М²⁺-АДФ-исимому ингибированию.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является выяснение кинетических законо-ностей М^-АДФ-зависимого ингибирования CFi-АТФазы хлоропла-з в процессе гидролиза АТФ. В процессе исследования решались сле-іщие задачи: Изучение кинетики 1^²⁺-АДФ-завиеимого ингибирования CFi-АТФазы;

1. Определение кинетических характеристик связывающего АДФ центрі участвующего в ингибировании фермента;

2. Изучение взаимодействия Mg²⁺ с CFi-АТФазой в процессе Mg^-АДй зависимого ингибирования;

3. Выяснение способности фермента, дефицитного по минорным субьеді ницам (CFi-6, є) к М²⁺-АДФ-зависимому ингибированию.

Научная новизна работы.

Впервые показано, что в присутствии АДФ и ионов Mg²⁺ пpoиcxoд^ медленная обратимая инактивация CFi -АТФазы хлоропластов. Выявлен изменения кинетических параметров на различных этапах инактивации фе] мента. Обнаружено, что инактивация CFi сопровождается увеличение сродства одного из нуклеотидсвязывающих центров к АДФ, другого центі к АТФ и снижением сродства к АТФ третьего центра. Впервые показано, чт при удалении минорных 8 и є субъединиц CFi-5, є сохраняет способность ^²⁺-АДФ-зависимой инактивации. Впервые применительно к сопрягают му фактору хлоропластов CFi показано, что Mg²+ и Н⁺ конкурируют за ев зывание с кислотно-основными группами, ответственными за инактив цию/активацию CFi-АТФазы. Эти группы локализованны на уровне катал тнческой части CFi и играют решающую роль в регуляции функциональні активности АТФ-синтазного комплекса.

Практическое значение работы.

Полученные в работе данные расширяют представления о регулятс ных свойствах Н⁺-АТФазы хлоропластов. Результаты, представленные диссертации, могут быть использованы для дальнейшего изучения молеь лярного механизма функционирования АТФ-синтазных комплексов хлор пластов, митохондрий и бактерий.

Апробация работы.

Основные результаты работы докладывались на Всесоюзном симг зиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмеї (Пущино, 1986), на Всесоюзных конференциях "Преобразование светов энергии в фотосинтетических системах и их моделях" (Пущино, 19S "Структурно-функциональная организация фотосинтетических мембрі (Пущино, 1993), "Биоэнергетика фотосинтеза" (Пущино, 1996), на 7-ом и ом Международных конгрессах по фотосинтезу (Провиденс, 1986; Монт лье, 1995).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), о сания методов исследования (10 разделов), изложения полученных резулі тов и их обсуждения (4 главы), заключения, выводов и списка цитируен литературы (263 ссылки). Работа изложена на страницах, содер; 22рисунка и 2 таблицы.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 1. Препаративные методы.

CFi-АТФазу выделяли из хлоропластов шпината по методу Биндера и соавт. (Binder et all., 1978). Очистку препарата CFi проводили согласно методу Шапиро и МакКарти (Shapiro et all., 1990). Выделение CFi хлоропла-л-ов, дефицитного по 5 и є субъединицам проводили по методу Рихтера и х>авт. (Richter et all., 1986). Для исследования кинетики гидролиза АТФ ис-тользовали предварительно активированный фермент. Активировали CFi-ІТФазу по методу Льена и Рекера (Lien and Racker, 1971).

Ї. Аналитические методы.

Концентрацию белка в препаратах CFi определяли по методу Бред-[)орд (Bradford, 1976). Для контроля чистоты препарата растворимой АТФа-ы хлоропластов использовали электрофорез на пластинах 15% полиакрила-шдного геля в присутствии додецнлсульфата натрия в буферной системе Ізммлн (Laemmli, 1970). АТФазную активность по окислению NADH, сопряженному с гидролизом АТФ определяли по методу Пульмана (Pullman et 11., 1960). Определение АТФазной активности фермента по освобождению еорганического фосфата проводили по методу Лоури и Лопеса в модифн-ации Скулачева (Обзор методов калориметрического определения фосфо-а, Никулина Т.Н., 1965). Концентрацию АДФ в реакционной среде в провесе инактивации CFi-АТФазы рассчитывали согласно методу Мальяна Мальян, 1981). Для определения количества прочно связанных ферментом уклеотидов использовали метод радиоактивного анализа (Мальян, 1990) и юциферин-люциферазный метод (Strehler, 1965).