Введение к работе
Актуальность проблемы. Поддержание ионного гомеостаэа является непременным условием существования как клетки, так и организма в целом. Ключевую роль в эгои процессе играют ион-транспор-тирующие системы, осуществляющие пассивный, активный и вторично-активный транспорт. Среди вышеупомянутых систем большой интерес представляют Na+/H+-обмен и Na+,К+,С1"-котранспорт, обнаруженные в плазматических мембранах многих типов клеток. Na+/H+-обмен принимает участие в трансэпителиальном движении воды и ионов, регуляции внутриклеточного рН и процессах пролиферации (Grinstein, Rothstein, 1986). Na+,К+,С1~-котранспорт вовлечен в процессы ре-абсорбции и секреции ионов з эпителиальных тканях (О'Grady et al., 1987).
Как Na+/H+-обмен, так и Na+,К*, С1~-котранспорт активируются в ответ на гиперосмотическое сжатие клеток in vitro. В ряде случаев активация этих ион-транспортирующих систем приводит к генерации нетто потоков ионов и осмотически сопряженного тока воды, направленных в клетку, следствием чего является восстановление клеточного объема (Sarkadi, Parker, 1991). In vivo уменьшение клеточного объема может происходить при изменении осмолярности внеклеточной среды или цитоплазмы. У высших животных осмолярность внеклеточной жидкости постоянна, и большинство клеток не подвергается осмотическому стрессу. Однако, в почечной ткани, эпителии дыхательного и желудочно-кишечного тракта и системе воротной вены происходят значительные изменения внеклеточной осмолярности даже при физиологических условиях. В свою очередь эритроциты, проходя через капилляры почки, кишечной стенки и печени, оказываются в гиперосмотических условиях. В настоящее время изучению объемной
регуляции ионного транспорта уделяется много внимания, так как объеи-чувствительные ионные потоки не только ответственны за поддержание клеткой постоянного объема, но также могут играть существенную роль при росте и пролиферации клеток, для которых необходимо сбалансированное увеличение содержания органических и неорганических веществ, клеточного объема и поверхности мембраны. Показано, что в некоторых типах клеток изменения клеточного объема и объем-чувствительные ионные потоки могут быть частью гормонального сигнала (Sarkadi, Parker, 1991).
Несмотря на накопленный обширный материал о системах Ыа+/Н*-обмена и Na+,К*,С1"-котранспорта в различных типах клеток, механизм стимуляции их активности при изменении клеточного объема остается невыясненным.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования состояла в изучении кинетических характеристик Na+/H+-обмена и Na+,К+,С1~-котранспорта, выяснении механизмов их активации при гиперосмотическом сжатии клеток и возможности участия этих ион-транспортирующих систем в регуляторном восстановлении объема клеток. В качестве объекта изучения были выбраны эритроциты крысы, для которых ранее было показано наличие объем-зависимого транспорта Na+ и К+ (Duhm, Gobel, 1984; Orlov et al., 1989).
В работе были поставлены следующие задачи:
1. Изучить кинетические характеристики Na+/H+-обмена (EIPA-
чувствительного транспорта Na* и Н*) и Na+,К+,С1"-котранспорта
(букетанид-чувствительного транспорта К* и Na+) в контроле и при
еросмотическом сжатии клеток.
2. Исследовать возможность вовлечения процессов фосфорилиро-
вания белков в гиперосмотическую активацию Na*/H*-обмена.
3. Оценить вклад Na*/H+-обмена и Na+,К+,С1~-котранспорта в регуляторное восстановление объема клеток в условиях гиперосмотического сжатия.
Научная новизна исследований. Впервые показано, что гиперосмотическое сжатие клеток может приводить к активации Na+/Na+-обмена, осуществляемого, по-видимому, изоформой NHE-1 Na+/H+-o6MeH-ника. Получены новые экспериментальные данные, свидетельствующие о влиянии реакций фосфорилирования-дефосфорилирования на Na+/Na+-обмен.
В эритроцитах крысы впервые выявлены особенности функционирования системы Na*,К*,С1*-котранспорта и получены новые доказательства возможности функционирования этой системы в качестве вторичноактивного транспорта Na*.
Измерены нетто потоки К* и Na* при гипероскотическом сжатии эритроцитов крысы, что позволило объяснить отсутствие регуляторного увеличения объема в этих клетках in vitro.
Практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представления о функционировании обьем-активируемых систем ионного транспорта и могут внести вклад в изучение патологических процессов, связанных с изменением клеточного объема (артериальной гипертензии, серповидноклеточной анемии, отеков мозга и гипертрофии органов).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 7 Всесоюзном симпозиуме "Механизмы сенсорной рецепции" Москва, 1992), на 2 международной школе FEBS ICRO "Биохимия мембранного транспорта" (Балатон Алига, 1993), на 23 Конференции FEBS (1995, Базель, Швейцария), на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ (Москва, 1995).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 220 наименований. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, включая 7 таблиц и 24 рисунка.