Введение к работе
Актуальность проблеми.
Цитохром Р-450-содоржащая монооксиге'назная система микросом печени является ключевой ферментной системой, отвечающей за окисление-низкомолекулярных чужеродных соединений, с последующим удалением их метаболитов из ' организма экскреторными органами [Arohakov АЛ. & Bachmanova 0.1., 1990; Parke et al., 19911. В связи с важностью реакций гидроксилирования, протекающих с участием цитохрома Р-450, исследователями уделяется большое внимание искусственным системам, позволящим моделировать реакции-микросомального окисления. Обычно в этих системах в качестве косубстрата применяется не nadph, а гидроперикись кумила (ГПК) или перекись водорода (HgOg), что позволяет использовать содержащийся в них активный кислород для непосредственного окисления низкошлекулярных субстратов [Метелица Д.И., 1982; Карузина И.И. и соавт., 1983; Arohakov АЛ. & Baohmanova __ G.I., 1990].
Наряду с хорошо изученной детоксицирувдей функцией монооксигеназной система, было установлено,- что в процессе окисления возможно образование высокотоксичных промекуточных метаболитов, способных ковалентно связываться с биомакромолекулами (нуклеиновыми кислотами, белками, а также с фосфолипиднші! бислоем мембран) [Арчаков А.И. и соавт, 1980; Ковалев И.Е., Полевая О.Ю., 1985; Gillete, 1974, butz, 1979; S?atkine,1990; Johnson, 1992; liurrau et al,1992]. Особенно хорошо этот процесс изучен на примере полициклических ароматических углеводородов, в частности 3,4-бензпирвна [Nebert et al., 1982].
Ковалентная модификация реакционносшсоОными метаболитами низкомолекулярных соединений биомакромолекул . может приводить к мутагенезу, канцерогенезу, некрозу тканей и развитии других патологических состояний [Araes et al., 1975; Nebert & Jensen, 1979; Miller & Uiller.1982; Guengerioh et al.,1990; Miles & Wolf, 1991; Eberhart et al.,1992]. Так например, в случае ковалентной модификации метаболитами низкомолекулярных соединений водорастворимых белков образуется конъвгированный антиген, который, попадая в кровь, индуцирует, согласно теории Ландштейнера [Landsteiner, 1936), синтез антител, специфичных к
низкомолекулярной детерминанте. Протекание подобной реакции в организме экспериментальных кивотнкх было продемонстрировано в работе Арчакова А.И. и соавт. [1980). Как следствие этого процесса возможно возникновение аллергических заболеваний.
Вместе с тем, необходимо отмотать, что в процессе такой модификации также возможно изменение иммунологических свойств высокомолекулярного соединения, что вызовет индукцию синтеза антител, специфичных к модифицированному макроносителю. Цель и задачи исследования.
Целью данной работы явилось получение конъюгатов продуктов окисления 3,4-бензпирена с белками, катализируемое цитохромом Р-450, с гаследуодим анализом иммуногенности образующихся конгюгкрованных антигенов.
Эта цель предусматривает решение следующих задач:
-
Сравнение скоростей окисления 3,4-бензпирена (БП) микросомами контрольных и индуцированных животных в полной и шунтировании* системах.
-
Сравнение скоростей окисления 3,4-бензпирена в микросомах к монооксигеназных растворимых реконструированных системах (РРС) при использовании в качестве косубстратов NADPH, ГПК и Н202-
-
Нахождение условий наиболее интенсивного ковалентногс связывания метаболитов 3,4-бензпирена с кроличьим сивороточнш альбумином (КСА).
-
Синтез конъюгатов метаболитов БП с КСА и БП < мик'росомольной фракцией печени кролика <МККр), катализируемы! цитохромом Р-450, в присутствии косубстрата, при которої наблюдается наиболее интенсивное связывание мотаболитої 3,4-бензпирена с КСА.
-
Определение иммуногенности конъюгатов метаболита 3,4-бензпирена с КСА или микросомами кролика по появлению циркулирующей крови как антител к . 3,4-овнзпирену, так лимфоцитов, несущих на своей поверхности рецепторы, связывании БП.
-
Выявление антител к высокомолекулярному носителю (КСА ковалентно модифицированному метаболитами БП.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В результате проведенных экспериментов по изучен*
скорости окисления БП микросомами различных типов индукций и в РРС, а также исходя из датшх по измерению ковалентного связывания метаболитов БП с КСЛ, показано, что БП относится к группе субстратов, механизм окисления которых различен в пунтировэншх системах к в полном шнооксигеназном цикле. Показано,' что максимальное количество метаболитов БП, связывающихся с альбумином, наблюдается при добавлении в среду инкубации макросом печени кроликов, индуцированных 3-метилхолантреном (MX), а в качестве кофактора - nadph.
Выявлено, что иммунизация кроликов коваленотносвязакными конъюгатами БП-КСА и Bn-WKKp приводит к появлению антител,' специфичных к БП не только в крови животных, но и на лимфоцитах.
Установлено, что при иммунизации кроликов ковалентносвязан-ными конъюгатами БЛ-НСА или БЛ-МККр, синтезированными в микросомальнои* монооксигеназной системе, наблюдается синтез антител, не только к низкомолекулярной детер/янанте, но и к аллогенному высокомолекулярному носителю (альбумину), модифицированному продуктами окисления БП.
Основная часть работы представляет интерес в понимании функциональной роли цитохрома Р-450 печени ишотннх и человека. Экспериментальные подхода данной работы в настоящее время применяются в ряде лабораторий, занимающихся исследованием микросомальной моноокскгевазной системы печани и окислением ксенобиотиков, а также в иммунологических лабораториях. Результаты работы используится в учебном процессе в спецкурсах на кафедре биохимии медико-бвологичвского факультета РГМУ..
Апробация диссертации. Результаты исследований были доложены на Всесоюзных конференциях "Цигохром Р-450 и ограна окружающей среды" (Новосибирск, 1987). "Цятохром Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, IS89), на 7-ой Меадународной конференции "Biochemistry & ВіорЬузіов of Cytochrome P-450; Structure & Punotion, Biotechnological & Ecological Aspects" (Москва, І99Г), а также на совместном заседании учебно-научного комплекса кафедры биохимии МВФ 2-го МОЛГМИ им.Н.И.Пирогова и института биологической и медицинской химии АМН СССР (26 июня 1991).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Структура и объем работа. Диссертация излокена на 126
страницах машинописного текста, включая 12 рисунков и 12 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, глав, содержащих описание материалов и методов исследования, экспаримвнтальной части с результатами исследования,, обсувдения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы.