Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Общие сведения о глутамин(аспарагин)азах . . 9
1.1. Методы выделения и очистки глутамин-(аспарагин)
1.2. Влияние физико-химических факторов на активность и стабильность дезамидаз . . 12
ГЛАВА 2. Исследования структуры дезамидаз
2.1. Молекулярная масса и субъединичное строение
2.2. Аминокислотный состав и первичная структура 33
2.3. функциональные группы активного центра
и их модификация 35
ГЛАВА 3. Субстратная специфичность и ингибиторы глутамин(аспарагин)
3.1. Реакции, катализируемые глутамин(ас-парагин)азами
3.2. Константы Михаэлиса 45
3.3. Механизм действия 45
3.4. Аффинные метки 49
3.5. Обратимые ингибиторы 55
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 4. Соединения, использованные в работе
4.1. Реактивы и их очистка 61
4.2. Очистка глутамин(аспарагин)азы 61
а) Источник выделения фермента 62
б) Культивирование микроорганизма ... 63
в) Приготовление ацетонового порошка . . 63
г) Выделение фермента 64
д) Доказательство гомогенности фермента
с помощью диск-электрофореза 67
ГЛАВА 5. Методы определения белка и активности фермента
5.1. Определение белка 70
5.2. Определение активности с помощью реактива Несслера 70
5.3. Определение активности с помощью глутаматдегидрогеназы 72
5.4. Определение активности в реакциях гидролиза и синтеза гидроксаматов дикарбоновых аминокислот 73
ГЛАВА 6. Исследование каталитических свойств глутамин(аспарагин)азы
6.1. Субстратная специфичность 75
6.2. Влияние концентрации субстратов на скорость реакций гидролиза и гидро-ксиламинолиза 77
6.3. Влияние рН и температуры на активность и стабильность фермента .... 78
6.4. Действие L-глутамата на процесс тепловой инактивации фермента .... 79
6.5. Влияние катионов металлов и метаболитов на ферментативную активность. . . 80
6.6. Ингибирование фермента дикарбоновыми аминокислотами 81
6.7. Кинетика инактивации глутамин(аспара-гин)азы под действием ДОН и азасерина. . 81
6.8. Влияние рН и температуры на инактивацию фермента под действием ДОН 82
6.9. Влияние лигандов на ингибирование фермента ДОН 33
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 7. Исследование оптимальных условий функционирования глутамин(аспарагин)азы
7.1. Влияние рН и температуры на активность
и стабильность глутамин(аспарагин)азы
7.2. Регуляция активности глутамин (аспарагин)азы 9Q
а) Влияние метаболитов на активность фермента
б) Влияние катионов металлов на активность фермента
ГЛАВА 8. Изучение взаимодействия фермента с эффекторами в условиях термоинактивации
8.1. Кинетика инактивации фермента при в присутствии L-глутамата . . 97
8.2. Влияние структуры эффекторов на тепловую стабильность фермента . . . юо
ГЛАВА 9. Субстратная специфичность глутамин(аспарагин) азы
9.1. Реакции гидролиза. Определение для ь -глутамина и L -аспарапша .. Ю5
9.2. Трансферазные реакции 108
9.3. Влияние рН на гидролиз и синтез гидроксамовых кислот 109
9.4. Зависимость скорости трансферазной реакции от концентрации субстратов . . 109
ГЛАВА 10. Исследование каталитических свойств глутамин(аспарагин)азы методами ингибиторного анализа
10.1. Влияние аналогов субстратов и продуктов на ферментативную активность 114
10.2. Определение кинетики процесса ингибирования фермента ДОН и азасерином 118
10.3. Изучение взаимодействия фермента с іі-аспартатом в условиях инактивации ДОН 123
10.4. Влияние структуры аналогов субстратов на инактивацию фермента
под действием ДОН 126
10.5. Влияние температуры и рН на ингибирование фермента ДОН .... 127
10.6. Влияние органических кислот и их аналогов на взаимодействие фермента с ДОН 130
10.7. Стабилизация фермента от инактивации при низких значениях рН . . . 132
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 134
ВЫВОДЫ 144
ЛИТЕРАТУРА 146
- Методы выделения и очистки глутамин-(аспарагин)
- Молекулярная масса и субъединичное строение
- Реакции, катализируемые глутамин(ас-парагин)азами
- Очистка глутамин(аспарагин)азы
- Определение активности с помощью реактива Несслера
Введение к работе
данная работа является частью исследования структуры и функций антиопухолевых ферментов, проводимого по заданию Госкомитета СССР по науке и технике и имеет номер государственной регистрации 01.830062362.
Глутамин(аспарагин)аза ( L -глутамин-( ь -аспарагин)амидо-гидролаза, КФ 3.5.1.38)/1.7 является перспективным антиопухолевым ферментом и представляет большой интерес для клинической онкологии. Предварительная положительная оценка пригодности фермента для клинических испытаний предполагает знание особенностей его каталитического действия. Изучение глутамин(аспарагин)азы имеет поэтому не только важное теоретическое значение с точки зрения зависимости между структурой и функцией, а также с точки зрения эволюционной биохимии микроорганизмов, животных и растений, но и несомненное прикладное назначение.
Целью настоящей работы было изучение особенностей каталитического действия глутамин(аспарагин)азы, выделенной из отечественного продуцента Ps. aurantiaca ВКМ-548.
Поставленная цель определила следующие основные задачи:
1. Определение оптимальных условий функционирования фермента.
2. Исследование регуляции активности фермента; поиск специфических активаторов и ингибиторов.
3. Изучение условий стабилизации фермента при тепловой инактивации.
4. Изучение субстратной специфичности фермента.
В качестве объекта исследования использовали гомогенный препарат глутамин(аспарагин)азы, полученный по разработанному ранее в лаборатории методу из Ps. aurantiaca ВКМ-548/"34,35 7.
Научная новизна работы заключается в выяснении основных каталитических свойств глутамин(аспарагин)азы в соответствии с поставленными задачами, в том числе условий стабилизации и особенностей взаимодействия фермента с эффекторами. В работе приведены экспериментальные доказательства того, что ДОН и азасерин являются аффинными ингибиторами глутамин(аспарагин)азы. Установлено, что фермент удовлетворяет основным требованиям первичного отбора ферментов, пригодных для испытания на антиопухолевуго активность: проявляет высокую каталитическую активность и стабильность при физиологических значениях рН, имеет низкие значения к для ь-глу-тамина и L -аспарагина и относительно невысокое сродство к продуктам реакции. К особенностям действия фермента относятся высокий температурный оптимум (55-70°), отсутствие активации ионами металлов и метаболитами цикла Кребса. Показано, что повышение термостабильности фермента, вызванное рядом аминокислот, обусловлено связыванием заряженных -амино- и х -карбоксильных групп эффекторов с молекулой фермента. Обнаружена способность глутамин(ас-парагин)азы в кислой области рН связывать дикарбоновые оксикислоти (цитрат и DL-малат); получены доказательства, что DL-ма-лат присоединяется к активному центру фермента.
Установление этих важнейших свойств фермента служит основой для дальнейшего изучения структуры и механизма действия глутамин-(аспарагин)азы. Выяснение механизмов регуляции активности глута-мин(аспарагин)азы в присутствии субстратов, аналогов субстратов и продуктов реакции несомненно будет способствовать решению проблемы клинического применения фермента в терапии опухолей.
Методы выделения и очистки глутамин-(аспарагин)
Ферменты, катализирующие гидролиз амиднои группы ъ -глута-мина и L -аспарагина, весьма широко распространены в природе и встречаются в объектах как животного, так и растительного происхождения, а также у микроорганизмов /""29, 202_/. По сравнению с глутаминазой (КФ 3.5.1.2) и аспарагиназой (КФ 3.5.1.3), бифункциональный фермент, имеющий примерно одинаковое сродство к обоим амидам, открыт сравнительно недавно.
Впервые о получении высокоочищенного препарата фермента, наделенного высокой аспарагиназой и глутаминазной активностью сообщили Рамадан и др. /164 7. В настоящее время изучению распространения и регуляции бифункциональных ферментов у микроорганизмов уделяется большое внимание /Т4, 18, 21, 38, 42, 55, 61, 147, 166, I67.J.
Имеется немало публикаций, в которых подробно описывается выделение и очистка бифункциональных дезамидаз из ряда микроорганизмов. Они рассмотрены ниже ( раздел I.I). Фермент получил систематическое название ь-глутамин( L -аспарагин)амидогидролаза и порядковый номер КФ 3.5.1.38; в качестве рабочего наименования комиссия по номенклатуре ферментов рекомендовала название - глута-мин(аспарагин)аза / 45_7. Следует, однако подчеркнуть, что в литературе применяются и некоторые другие названия этого фермента: глутаминаза А (фермент из ps. aeruginosa), глутаминаза (фермент из Ps. P-2I0), глутаминаза-аспарагиназа (ферменты из Acineto-bacter glutaminasifleans Ps# 7A, Ps. aurantiaca» Ps.boreopolis) L -аспарагиназа В (фермент ИЗ Acinetobacter calcoaceticus ), аспарагиназа-глутаминаза (фермент из Ps.acidovorans $ с. freundii Ps. genicuiata ), дезамидаза АГ (фермент из ps, fluorescens АГ). Ниже в обзоре во избежание путаницы для всех этих ферментов будет употребляться название глутамин(аспарагин)аза.
Повышенный интерес исследователей к глутамин(аспарагин)азе объясняется способностью этого фермента подавлять рост некоторых опухолей. В 1961 году Брум / 65_/ показал, что открытая Кидом / 122, 123__7 антилимфомная активность сыворотки морской свинки обусловлена L-аспарагиназной активностью. Впоследствии препараты L-аспарагиназы, выделенные из микроорганизмов, получили применение в клинической практике при лечении некоторых опухолей / 74, 90, 99, 104, 152, 192, 202J . Однако широкое применение ь-аспарагиназы в лечении онкологических заболеваний ограничено с одной стороны узким спектром противоопухолевой активности (в основном она действует на лимфолейкозы), с другой стороны, развитием иммунитета и аллергий при многократном применении препарата из одного источника /""83, 182_/. Решению этих проблем может способствовать расширение круга ферментов, используемых в онкологии. Так, было показано, что микробная глутамин(аспарагин)аза обладает мощным противоопухолевым действием / Е00, 124, 125, І54_7. В настоящее время этот фермент нашел применение в лечении опухолей человека /"100, 125, 192_7. Лечебный эффект дезамидаз усиливается при комбинированной применении с друтими химиотерапевтическими средствами /"82, 91, 100, 171, 174, 183_7.
Молекулярная масса и субъединичное строение
Молекулярные массы глутамин(аспарагин)аз из различных микроорганизмов представлены в таблице 3. Как видно, молекулярная масса ферментов, определенная различными методами, колеблется в пределах от 96 до 180 кД. Исключение составляет лишь фермент из Ps . GG ІЗ, имеющий необычно низкую молекулярную массу 25 кД / 164_7. Для сравнения в таблице даны молекулярные массы некоторых аспара-гиназ и глутаминаз. Видно, что дезамидазы имеют близкие молекулярные массы. Высокая молекулярная масса аспарагиназы дрожжей (800 кД) по мнению Брума / 66__/ является результатом агрегации фермента.
Сокращения: ГА - глутамин(аспарагин)аза; А - аспарагиназа;
А(А) - аспарагиназа А; Г - глутаминаза; Г(А) - глутаминаза
А; Г(В) - глутаминаза В.
а - Ультрацентрифугирование;
б - Гельфильтрация;
с - Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН;
д - На основании аминокислотного состава.
Глутамин(аспарагин)аза, также как и другие микробные дезамид-азы, имеет субъединичное строение. Как показано для большинства известных глутамин(аспарагин)аз, молекулу фермента образуют четыре субъединицы. Идентичность субъединиц в большинстве случаев подтверждается их одинаковой подвижностью при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Прямое доказательство идентичности субъединиц получено в опытах по частичной расшифровке первичной структуры ферментов из Рв. 7А и Ac. glutamina -sificans Z" 03_7. Однако, для глутамин(аспарагин)азы из ps . fluorescein АГ при диск-электрофорезе с ДСН были выявлены два белковых компонента с разными молекулярными массами, 30 и 42 кД / 48__7. Авторы объясняют неодинаковое поведение субъединиц наличием связанного углеводного компонента с массой 12 кД.
Отдельно изучалась стабильность дезамидаз, связанная с сохранением четвертичной молекулы / 68, 84, 106, 107, 109, НО, 140, 153, 178, 190_7. Холсенберг и др. /""106, Ю9__7 в опытах по седиментации наблюдали диссоциацию тетрамерной молекулы глутамин(ас-парагин)азы из Ac. glutaminasificons на димеры. Кроме того, отмечено образование агрегированных форм в опытах с гликозилированным препаратом фермента / Е06_/. Образование олигомерных форм наблюда - 28 лось также в опытах по зональной седиментации бифункционального фермента из - s.7A при концентрации белка свыше I мг/мл, а также в присутствии субстратов /"108_7. В присутствии 5,9 м гуанидин-хлорида молекула фермента распадается на субъедшшцы. В присутствии 6 М гуанидинхлорида, 8 М мочевины и 1% ДСН наблюдалась полная инактивация глутамин(аспарагин)азы из Ps. aeruginosa /153_/. После диализа частично восстанавливалась активность фермента, денатурированного мочевиной или гуанидинхлоридом, но не ДСН. Необратимое действие ДСН показано и для некоторых других ферментов: ас-парагиназ из Е. coli /""175_7 И V. succinogenes / 77_/, глута-миназы из Ps. aeruginosa / Т53_7. В то же время активность ас-парагиназы из Pr. vulgaris полностью восстанавливается после удаления ДСН с помощью гвльфильтрации, а также в результате простого разбавления "190_/.
Как установили Шифрин и др. T7S_7f D-аспарагин предохраняет аспарагиназу Е. СОІІ от инактивации под действием 4,8 М мочевины и препятствует распаду молекулы фермента на субъединицы.
L - и D-аспарагиновая кислоты, в концентрации 0,01 М, не защищали фермент от инактивации.
Сравнение стабильности аспарагиназ из Erw» carotovora и Е . coli показало, что аспарагиназа Erw« carotovora более стабильна при щелочных значениях рН. В опытах по ультрацентрифугированию найдено, что фермент изЕг\/. carotovora сохраняет тетрамерную форму при рН от 3 до 12, тогда как фермент из Е. coli диссоциирует на субъединицы при рН 11,8 / 68__/. Аспарагиназа из Erwcarotovora сохраняет тетрамерную структуру даже после 7-Ю дней хранения при 4 в области рН 3-11,3.
Реакции, катализируемые глутамин(ас-парагин)азами
В таблице 4 представлены константы Михаэлиса глутамин(аспа-рагин)аз. Видно, что большинство из этих ферментов отличается вы-соким сродством к L-глутамину и L-аспарагину ( % 10 -10"%). Однако, можно выделить несколько глутамин(аспарагин)аз с невысоким сродством к L-глутамину и L-аспарагину ( к 10 М). К ним, в частности,относятся ферменты, выделенные из Ps .
GG 13 / 165_7 и Ac, calcoaceticus Z II9J\ Для сравнения в таблице представлены также кт некоторых аспарагиназ и глутаминаз. Как видно из таблицы, аспарагиназы отличаются высоким сродством к L-аспарагину ( 1 ПГ5М), однако их сродство к L-глутамину значительно ниже, чем у глутамин(аспарагин)аз (в 10-100 раз).
Для глутаминаз составляет величину порядка 10-10 М (по отношению к L-глутамину).
3.3. Механизм действия
Механизм действия глутамин(аспарагин)азы до последнего времени практически не исследовался. Предполагалось, что фермент имеет общий активный центр для дезамидирования L-глутамина, L -аспарагина и их D-изомеров /"75, 166, 167_/. Недавно были опубликованы результаты изучения кинетических свойств глу-тамин(аспарагин)азы из Acinetobacter , которые свидетельствуют, что гидролиз L-глутамина и ь-аспарагина осуществляется согласно упорядоченному механизму, и что связывание субстратов осуществляется общим активным центром /" I84J/\ Авторы считают, что в реакции образуется тетраэдрический комплекс (в результате взаимодействия фермент-субстратного комплекса с водой),представляет интерес рассмотреть и проанализировать работы, посвященные механизму действия аспарагиназы и глутаминазы.
Для аспарагиназы из Е. coli рассмотрены два возможных пути протекания реакции / 80_J/. Один из них согласуется с механизмом двухстадийного замещения (I), а второй включает прямую атаку воды (или гидроксиламина) на амидную связь субстрата (П):
Очистка глутамин(аспарагин)азы
В работе использовали: ь-глутамин, н-ацетил- L -глута-мин, О-диазоацетил- ъ-серии, малеиновую кислоту, додецилсульфат натрия, кумасси бриллиантовый голубой R-250 фирмы "Serva" (ФРГ), L-аспарагин, 6-диазо-5-оксо- ь-норлейцин, ь-метионин-суяьфон, ь-метионин-Біі-сульфоксимин, ь- $ -глутамил- п. -ни-троанилид, метотрексат, аминоптерин, фолиевуго кислоту, о -кето-глутарат натрия, -кетобутират натрия, янтарную кислоту, D--фруктозо-I,6-дифосфат, пируват, оксалоацетат, MES / 2-( N--морфолино)этансульфоновую кислоту__7. PIPES /"пиперазин- н ,
и -бис(2-этансулъфонат натрия}/» HEPES С и-2-оксиэтилпи-перазин- N -2-этансульфоновую кислоту/ фирмы " Calbiochem" (США),
L-глутамат натрия фирмы "Sigma" (США), глутаматдегидрогеназу из печени крупного рогатого скота в 50% глицерине фирмы "Регак" (ФРГ), сывороточный альбумин быка фирмы "Pluka" (Швейцария) и фирмы "Calbiochem (США), L-лактат лития, фирмы "Germed" (ГДР),
и-КБЗ- L-аспарагин, и-БОК- L-аспарагин, и-КБЗ- L -глу-тамин, ь-аспарагиновуго кислоту, глицин, -аланин, НАД восстановленный, трис, акриламид, N, ж -метиленбисакриламид, пер сульфат, аммония, N , н,н , ж -тетраметилэтилендиамин, глицин фирмы "Reanal" (Венгрия), ультрагель АсА-44 фирмы "ькв" (Швеция), сефадекс G-50, ДЭАЭ-сефадекс А-50 фирмы "Pharmacia" (Швеция).
Акриламид, додецилсульфат натрия и трис перекристаллизовы-вали из &0% этанола.
L-аспарагиновую кислоту освобождали от примеси аммиака путем выдерживания при щелочном рН.
Гидроксиламин солянокислый и гидроксиламин сернокислый были перекристаллизованы из 70$ этанола.
Для приготовления растворов использовали деионизованнуго воду.
Остальные реактивы были отечественного производства марки не ниже ъ а,.
L-Глутамил- у -гидроксамовая и L-аспартил- Л -гидрокса-мовая кислоты были синтезированы в Институте биологической и медицинской химии АМН СССР в лаборатории органической химии с.н.с. Ковальчук О.В.
Реактив Несслера (смесь комплексной соли K2/kgJJ с КОН) готовили как описано, с некоторыми модификациями / 33_7 :
В 15 мл деионизованной воды растворяли 10 г йодистого калия. Добавляли 15 г HgJ2 , тщательно перемешивали и туда же приливали 80 мл 50$-ного раствора натриевой щелочи. Перемешивали и общий объем доводили деионизованной водой до 500 мл. Раствор оставляли на сутки для формирования осадка. В работе использовали прозрачную надосадочную жидкость, полученную путем декантации.
Определение активности с помощью реактива Несслера
Белок определяли по методу Лоури / Е36_7. В процессе выде-деления белок определяли также спектрофотометрическим методом, измеряя оптическую плотность при 280 нм.
Определение активности с помощью реактива Несслера / Т43, 201_7
Метод основан на измерении количества аммиака, образующегося в реакциях гидролиза амидов дикарбоновых аминокислот:
Этот метод использован при выделении и очистке глутамин-(аспарагин)азы, а также при изучении физико-химических и некоторых кинетических свойств фермента.
Определение активности фермента в процессе очистки
Инкубационные пробы объемом 1,0 мл содержали 25 мкмоль L -глутамина и L -аспарагина, 0,01 М трис-нсі буфер рН 7,2 и 0,01-02 ед фермента. Реакцию начинали добавлением глутамин-(аспарагин)азы. Пробы инкубировали 10-20 мин при 37. Реакцию останавливали добавлением 0,1 мл 50$ раствора трихлоруксусной кислоты. Смесь центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 мин. Для определения аммиака из супернатанта отбирали 0,1-0,2 мл, доводили деионизованнои водой до 4 мл и прибавляли 0,25 мл реактива Несслера. Через I мин (но не позднее 3 мин) измеряли оптическую плотность раствора при 400 нм. Концентрацию аммиака определяли по калибровочной кривой. В качестве стандарта использовали перекристаллизованный сульфат аммония. Растворы субстратов несколько дней можно хранить в замороженном состоянии в холодильнике .
При определении активности гомогенного фермента условия были те же (если нет специальных указаний в последующих разделах), но не применяли центрифугирование.
Модифицированный метод Конвея
В отдельных опытах перед измерением аммиака использовали его предварительную отгонку из инкубиционной смеси по методу Конвея в модификации А.И.Силаковой 4Qj с небольшими изменениями. Исследуемую пробу объемом 0,5 мл помещали в пенициллино-вую склянку, туда же добавляли 0,7 мл насыщенного раствора К2СО3. Склянку быстро закрывали пробкой со стеклянной палочкой, конец которой был смочен I н неї Затем склянку помещали на качалку (100 качаний в мин) на 2,5 часа при комнатной температуре. После этого пробку с палочкой переносили в пробирку, содержащую 3,8 мл деионизованной воды и 0,2 мл реактива Нессе-ра. Взбалтыванием смывали с палочки серную кислоту с поглощенным аммиаком и через 15 мин измеряли оптическую плотность раствора при 400 нм.