Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Методы анализа каталитической активности цитохромов Р450 (Обзор литературы) 11
1.1. Молекулярная организация цитохром Р450-зависимой монооксигеназной системы 11
1.2. Цитохром Р450-зависимый метаболизм лекарственных препаратов 16
1.3. Цитохром Р450 как молекулярная мишень для действия противоопухолевых лекарственных препаратов 18
1.4. Активация молекулярного кислорода цитохром Р450-зависимыми
системами и роль защитной антиоксидантной системы организма 24
1.5. Методы анализа субстрат-ингибиторного потенциала цитохрома Р450 29
1.5.1. Спектральные методы исследования цитохрома Р450 29
1.5.1.1. Абсорбционная спектроскопия 30
1.5.1.2. Флуоресцентная спектроскопия 32
1.5.1.3. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса 34
1.5.1.4. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 35
1.5.1.5. Рамановская спектроскопия 36
1.5.1.6. Мёссбауэровская спектроскопия 37
1.5.1.7. Рентгеновская спектроскопия
1.5.2. Хроматографические/хромато-масс-спектрометрические методы 39
1.5.3. Метод поверхностного плазмонного резонанса 40
1.5.4. Метод атомно-силовой микроскопии 41
1.5.5. Молекулярно-генетические методы 42
1.5.6. Электрохимические методы исследования цитохрома Р450 43
1.5.7. Заключение 68
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Реактивы 71
2.2. Оборудование 75
2.3. Методики исследований 76
2.3.1. Синтез коллоидного раствора золота (золотых наночастиц), стабилизированного ДДАБ 76
2.3.2. Приготовление суспензии многостеночных углеродных нанотрубок (МУНТ) 77
2.3.3. Приготовление модифицированных ферментных электродов 77
2.3.4. Приготовление и иммобилизация CYP3А4 с цитохромом b5 78
2.3.5. Циклическая и квадратно-волновая вольтамперометрия 78
2.3.6. Определение электрокаталитической активности изоферментов цитохрома Р450 в режиме амперометрии 78
2.3.7. Определение пероксидазной активности CYP3A4 81
2.3.8. Определение пероксида водорода, образующегося в процессе электрокаталитической реакции 82
2.3.9. Спектральные исследования цитохрома Р450 82
2.3.10. Определение общей антиоксидантной активности 82
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 84
3.1. Разработка электрохимических систем для анализа каталитической активности клинически значимых изоферментов цитохрома Р450 84
3.1.1. Электрохимические характеристики иммобилизованных изоферментов цитохрома Р450
3.1.2. Электрокаталитическая активность иммобилизованных изоферментов цитохрома Р450 94
3.1.3. Электрохимический анализ ингибиторной активности оксазолиновых производных [17(20)E]-прегнена по отношению к CYP17A1 102
3.1.4. Электрохимический анализ влияния антиоксидантных метаболических препаратов на каталитическую активность CYP3A4 и CYP2C9 111
3.2. Исследование влияния цитохрома b5 на электрокаталитическую активность CYP3A4 122
3.3. Электрохимические системы на основе бактериальных изоферментов цитохрома Р450 127
3.3.1. Электрохимическая система на основе бактериальной С19 стероид-гидроксилазы (CYP260A1) 128
3.3.2. Электрохимические системы на основе бактериальных изоферментов цитохромов P450 семейства CYP109 136
Заключение 146
Выводы 148
Список сокращений и условных обозначений 149
Список литературы 155
- Цитохром Р450 как молекулярная мишень для действия противоопухолевых лекарственных препаратов
- Синтез коллоидного раствора золота (золотых наночастиц), стабилизированного ДДАБ
- Электрокаталитическая активность иммобилизованных изоферментов цитохрома Р450
- Электрохимический анализ влияния антиоксидантных метаболических препаратов на каталитическую активность CYP3A4 и CYP2C9
Введение к работе
Актуальность темы и степень ее разработанности. Поиск более эффективных, экономичных методов моделирования метаболизма физиологически активных соединений и лекарственных препаратов является одной из быстроразвивающихся областей биохимии и экспериментальной фармакологии. Моделирование метаболических путей превращения физиологически активных соединений и лекарственных препаратов проводится как с помощью компьютерных методов in silico, так и экспериментальным путем in vivo и in vitro с помощью ферментных систем.
Цитохромы Р450 (CYP) являются наиболее значимыми ферментами при проведении исследований по поиску новых лекарственных препаратов, их токсичности, лекарственной интерференции. Ряд изоферментов цитохрома Р450 млекопитающих участвует в метаболизме эндогенных соединений, таких как стероидные гормоны, жирные кислоты, эйкозаноиды, витамины и др. [Ortiz de Montellano P.R., 2015]. Цитохромы Р450 являются белками-мишенями при разработке новых противоопухолевых препаратов в случае гормон-зависимых онкологических заболеваний [Краснов Г.С. и соавт., 2014]. Так, ингибиторы ключевого фермента синтеза андрогенов – бифункционального CYP17А1, катализирующего 17-гидроксилазную и 17(20)-лиазную реакции по отношению к прегненолону и прогестерону, используются при лечении андроген-зависимого рака простаты [Gomez L. et al., 2015], а лекарственные препараты – ингибиторы CYP19А1 (ароматазы) – при лечении эстроген-зависимого онкопоражения молочной железы [Brodie A. et al., 2009]. В связи с этим ведутся поиск и разработка новых селективных ингибиторов CYP17A1 и CYP19A1, что, в свою очередь, требует создания экспериментальных методов высокопроизводительного скрининга большого количества новых химических соединений. CYP3A4 – изофермент, катализирующий биотрансформацию около 50 % всех лекарственных препаратов и эндогенных соединений, среди которых ряд стероидов [Ortiz de Montellano P.R., 2015]. CYP2C9 также метаболизирует большое количество лекарственных препаратов, в том числе антикоагулянты (S-варфарин), кроме того, этот изофермент катализирует эпоксидирование арахидоновой и линолевой кислот [Draper A.J., Hammock B.D., 2000], гидроксилирование витамина А [McSorley L.C., Daly A.K., 2000]. Лекарственная интерференция на уровне этих изоферментов цитохрома Р450 может обуславливать развитие серьезных побочных эффектов от проводимой лекарственной (в том числе и комплексной) терапии.
Исследование каталитической активности изоферментов цитохрома Р450 методами in vitro представляет определенную трудность и требует реконструирования монооксигеназной системы, так как каталитический цикл сопряжен с восстановлением иона железа гема цитохрома Р450, осуществляемым при участии редокс-партнерных белков. Для определения продуктов цитохром P450-зависимых каталитических реакций используются спектральные, хроматографические, масс-спектрометрические и радиоизотопные методы [Yoshimoto F.K., Auchus R.J., 2015]. Перспектива развития методов высокопроизводительного исследования субстрат-ингибиторного потенциала изоферментов цитохрома Р450 связана с миниатюризацией и автоматизацией процессов, уменьшением расхода фермента, реагентов, времени и стадий анализа, что, в свою очередь, ведет к снижению стоимости исследования. Особый интерес уделяется разработке электрохимических систем на основе рекомбинантных форм цитохрома Р450, которые перспективны для экспериментальной фармакологии и фармацевтической промышленности при исследовании субстрат-ингибиторного потенциала этих ферментов, поскольку не требуют реконструирования электрон-транспортной системы; донором электронов для восстановления цитохрома Р450 и инициирования каталитической реакции служит электрод [Schneider E., Clark D.S., 2013]. На основе анализа электрохимических характеристик изоферментов цитохрома P450 с помощью
электрохимической формы уравнения Михаэлиса-Ментен могут быть рассчитаны кинетические параметры ферментативных реакций (KМ, kcat, kcat/KМ). С помощью электрохимических систем на основе цитохрома Р450 может быть проведен количественный ингибиторный анализ. Применение взаимозаменяемых планарных электродов с минимальным размером рабочего электрода позволяет миниатюризировать процесс определения каталитической активности изоферментов цитохрома Р450, используя при этом минимальное количество дорогостоящего рекомбинантного фермента.
Таким образом, разработка электрохимических систем анализа каталитической активности клинически значимых изоферментов цитохрома Р450 является современным и весьма перспективным подходом при поиске, разработке и исследовании новых потенциальных препаратов, моделировании их цитохром Р450-зависимого метаболизма, выявлении лекарственной интерференции.
Цель диссертационной работы: разработать методы электрохимического анализа клинически значимых изоферментов цитохрома Р450 17А1, 3А4 и 2C9 для исследования влияния субстратов, ингибиторов и регуляторов на монооксигеназную каталитическую активность.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
-
Разработать электрохимические системы на основе рекомбинантных цитохромов Р450 человека: CYP17A1, CYP3A4, CYP2C9, иммобилизованных на химически модифицированных электродах.
-
Определить электрокаталитическую активность и кинетические параметры (KM, kcat, kcat/KM) иммобилизованных на электроде CYP17А1 (по отношению к прегненолону и прогестерону), CYP3А4 (по отношению к тестостерону и эритромицину), CYP2С9 (по отношению к диклофенаку) и провести масс-спектрометрический анализ продуктов электрокаталических реакций.
-
С помощью разработанной электрохимической системы выявить ингибиторы CYP17А1 среди новых оксазолиновых производных [17(20)Е]-прегнена как потенциальных противоопухолевых препаратов.
-
Применить разработанные электрохимические системы на основе CYP3А4 и CYP2С9 для исследования лекарственной интерференции на примере влияния антиоксидантных метаболических препаратов, применяемых в клинической практике, на каталитическую активность этих изоферментов. Личный вклад автора. Соискателем проработана отечественная и зарубежная литература по
теме диссертации. Автор диссертационной работы непосредственно принимал участие в планировании и постановке экспериментов, самостоятельно проводил необходимые расчеты и статистическую обработку полученных экспериментальных данных. Представленные в диссертационной работе результаты исследований получены либо лично соискателем, либо при его непосредственном участии.
Научная новизна работы. В работе впервые сконструирована электрохимическая система на основе рекомбинантного бифункционального CYP17А1, иммобилизованного на химически модифицированном печатном графитовом электроде, способного катализировать последовательные 17-гидроксилазную и 17(20)-лиазную реакции по отношению к прегненолону и прогестерону. Разработанная электрохимическая система на основе CYP17А1 использовалась для исследования ингибиторной активности новых оксазолиновых производных [17(20)Е]-прегнена. Среди исследуемых соединений выявлены эффективные ингибиторы электрокаталитической активности CYP17А1, что позволило продолжить дальнейшее исследование оксазолиновых производных [17(20)Е]-прегнена в качестве потенциальных противоопухолевых препаратов.
Разработанные электрохимические системы на основе рекомбинантных CYP3А4 и CYP2С9 впервые использовались для исследования влияния метаболических антиоксидантных
лекарственных препаратов на каталитическую активность этих изоферментов. Среди исследуемых препаратов выявлены эффективные регуляторы монооксигеназной каталитической активности, которые могут быть использованы в клинической практике в комплексной фармакотерапии у пациентов с особенностями цитохром Р450-зависимой биотрансформации лекарственных препаратов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Разработанные электрохимические системы на основе CYP17А1, CYP3А4 и CYP2С9 могут использоваться в экспериментальной фармакологии при скрининге субстратов, ингибиторов и регуляторов их каталитической активности, исследовании цитохром P450-зависимого метаболизма новых лекарственных препаратов, выявлении лекарственной интерференции на уровне I фазы метаболизма ксенобиотиков.
Методология и методы исследования. В диссертационной работе разработаны электрохимические системы для определения каталитической активности клинически значимых изоферментов цитохрома Р450 (CYP17A1, CYP3A4, CYP2C9), не требующие сложного реконструирования редокс-транспортной цепи, как при использовании классических методов исследования монооксигеназной каталитической активности, поскольку каталитическая реакция инициируется электронами с электрода. Анализ каталитической активности изоферментов проводился по регистрации изменений электрохимических параметров с помощью циклической, квадратно-волновой вольтамперометрии и амперометрии. На основе анализа электрохимических характеристик цитохрома Р450 с помощью электрохимической формы уравнения Михаэлиса-Ментен были рассчитаны кинетические параметры ферментативных реакций (KМ, kcat, kcat/KМ). Исследование механизмов цитохром Р450-зависимых электрокаталитических реакций по отношению к субстратам проводилось методами спектрофотометрии и хромато-масс-спектрометрии.
Положения, выносимые на защиту
-
Электрохимическая система анализа каталитической активности изоферментов цитохрома Р450.
-
Скрининг субстратов, ингибиторов и регуляторов клинически значимых изоферментов цитохрома Р450.
-
Анализ электрохимическими методами лекарственной интерференции и фармакологической регуляции монооксигеназной каталитической активности. Степень достоверности и апробация работы. Достоверность полученных результатов
подтверждена соответствующими методами обработки экспериментальных данных и независимыми методами анализа. Работа выполнена на высокотехнологическом оборудовании. Используемые методики исследования и интерпретация результатов корректны. Выводы диссертационной работы обоснованы и полностью соответствуют проведенным исследованиям. Основные положения диссертационной работы были представлены на VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2012» (Россия, Уфа-Абзаково, 2012), на Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы нано- и микроэлектроники» (Россия, Уфа, 2012), на IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой по органической химии (Россия, Уфа-Абзаково, 2013), на 18 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – Наука XXI века» (Россия, Пущино, 2014), на VIII «Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, Москва, 2015), на I Всероссийской конференции с международным участием «Химический анализ и медицина» (Россия, Москва, 2015), 20 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – Наука XXI века» (Россия, Пущино, 2016), IX Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2016» с
международным участием и Молодежной научной школой (Россия, Екатеринбург-Леневка, 2016), на кластере конференций по органической химии «ОргХим-2016» (Россия, Репино, Санкт-Петербург).
Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа, из которых 12 статей в рекомендованных ВАК РФ изданиях и 9 работ в сборниках трудов конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 190 страницах машинописного текста, включает 39 рисунков и 16 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Глава 1), материалов и методов (Глава 2), результатов и их обсуждения (Глава 3), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 310 источников.
Диссертационная работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 13-04-92695 ИНД_а, 14-04-91337 ННИО_а, 15-04-02939 А, 15-54-04090 Бел_мол_а) и Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013–2020 гг.
Цитохром Р450 как молекулярная мишень для действия противоопухолевых лекарственных препаратов
На первой стадии каталитического цикла субстрат (RH) присоединяется в активный центр низкоспиновой ферри-формы фермента ([-S-Fe(III)-H2O]) (1 на рис. 1.1.1.), ион железа гема которой в отсутствии субстрата связан с шестым лигандом – молекулой воды. При связывании цитохрома Р450 с субстратом ион железа смещается из плоскости порфиринового кольца в направлении пятого лиганда – атома серы (-S-) цистеинового остатка, при этом ослабляется связь между молекулой воды и дистальным гистидином апофермента, это приводит к вытеснению воды из координационной сферы иона железа (2 на рис. 1.1.1.), при этом образуется комплекс ферри-формы фермента с субстратом ([-S-Fe(III)][RH]). Связывание субстрата индуцирует переход иона железа гема из низкоспинового состояния в высокоспиновое, это, в свою очередь, вызывает смещение редокс потенциала в более положительную сторону и облегчает процесс восстановления иона железа гема электроном, поставляемым CPR (или ферредоксином/адренодоксином) (3 на рис. 1.1.1.), в результате образуется комплекс ферро-формы фермента c субстратом ([-S-Fe(II)][RH]). Ион железа гема цитохрома Р450 в восстановленном состоянии имеет высокое сродство к кислороду, являющегося косубстратом фермента; для примера, константа скорости второго порядка связывания кислорода камфорным цитохромом Р450 (CYP101A1) в присутствии субстрата имеет диапазон 0,8-1,7 М-1 с-1 (при 4-25С) [19, 20]. Связывание кислорода ионом восстановленного железа гема приводит к образованию ферро-окси-формы фермента ([-S-Fe(II)-O2][RH]), находящейся в равновесии с ферри-суперокси-формой ([-S-Fe(III)-O2(1–)][RH]), содержащей неспаренный электрон на дистальном атоме кислорода (4 на рис. 1.1.1.). Распад комплекса ферри-суперокси-формы фермента с субстратом в результате автокаталитической реакции приводит к образованию супероксидного радикала (О2-) и окисленной формы цитохрома Р450 ([-S-Fe(III)]). При продуктивном катализе комплекс ферри-суперокси-формы цитохрома Р450 с субстратом восстанавливается вторым электроном, поставляемым от CPR (или cyt b5 для ряда микросомальных изоферментов цитохрома Р450) либо от ферредоксина/адренодоксина, что приводит к образованию ферри-перокси-формы фермента ([-S-Fe(III)-O2(2–)][RH]), содержащей один отрицательный заряд на дистальном атоме кислорода и второй отрицательный заряд – делокализованный на атоме серы цистеинового лиганда (5а на рис. 1.1.1.). Последующее протонирование дистального атома кислорода ферри-перокси-формы фермента приводит к образованию ферри-пергидрокси-формы фермента ([-S-Fe(III)-OOH(1– )][RH]) (5б на рис. 1.1.1.), при распаде которой образуется пероксид водорода (H2O2) и окисленная форма цитохрома Р450 ([-S-Fe(III)]). При протекании продуктивного катализа ферри-пергидрокси-форма фермента протонируется, что облегчает разрыв связи О-О с образованием воды и высоковалентной феррильной формы цитохрома Р450 ([-S-Fe(IV)=O][RH]) (6 на рис. 1.1.1.), непосредственно участвующей в образовании окисленного субстрата (ROH на рис. 1.1.1.). Подробно молекулярные механизмы монооксигеназного катализа описаны в работах [21-23].
Таким образом, в результате активации молекулы кислорода и монооксигеназной активности цитохрома Р450 происходит образование окисленного более полярного, по сравнению с субстратом, продукта ферментативной реакции. В результате этого процесса может происходить активация или инактивация молекулы ксенобиотика, в том числе лекарственного соединения, или образование физиологически активного метаболита при биотрансформации эндогенного соединения.
Обязательным компонентом монооксигеназной каталитической системы II класса является НАДФН-зависимая цитохром Р450 редуктаза (CPR, EC 1.6.2.4) – флавопротеин, катализирующий перенос электронов от НАДФН к иону железа гема цитохрома Р450. В качестве простетической группы CPR содержит флавиновые коферменты – ФАД и ФМН. CPR имеет доменную молекулярную организацию и содержит в своем составе мембраносвязывающий домен, ФАД-связывающий домен, ФМН-связывающий домен, и линкерный домен [15]. ФАД-связывающий домен катализирует окисление НАДФН. ФМН-связывающий домен функционирует как акцептор электронов от восстановленного ФАД, так и в качестве переносчика электронов непосредственно к иону железа гема цитохрома Р450.
Синтез коллоидного раствора золота (золотых наночастиц), стабилизированного ДДАБ
Как правило, при рассеянии света его частота не меняется (упругое рассеяние); однако небольшая часть излучения, обычно в инфракрасной области спектра, рассеивается неупруго с изменением частоты – этот эффект называется рассеянием Рамана [149]. Причиной изменения частоты является либо возбуждение на более высокий колебательный уровень, либо добавление к электромагнитной энергии световой волны колебательной энергии молекулы [149]. Эффект Рамана лежит в основе метода Рамановской спектроскопии (спектроскопии комбинационного рассеяния). Основным преимуществом этого метода является возможность изучения колебательных переходов отдельных хромофорных групп сложной молекулы, например, цитохрома Р450, за счет облучения образца светом с длиной волны, при которой происходит колебательный переход отдельной группы такой молекулы [18]. В цитохроме Р450 такими хромофорными группами являются прежде всего порфирин и железо-аксиальный лиганд [150]. При взаимодействии изоферментов цитохрома Р450 с субстратами [18, 151, 152], ингибиторами [153] и другими лигандами, такими как NO [154], CN- [155] наблюдаются изменения характеристического Рамановского спектра (волнового числа и/или интесивности), отражающие конформационные перестройки в молекуле.
Рамановская спектроскопия применялась для исследования структурных изменений CYP3A4, встроенного в нанодисковые структуры, при взаимодействии с субстратами, а также CO и O2 [156]. В работе [152] с помощью Рамановской спектроскопии были зарегистрированы спектральные изменения CYP102A1 мутантных форм по Phe393 в ответ на восстановление иона железа гема или связывание с субстратом, которые объяснялись различиями в конформационных изменениях винильных или пропионильных групп порфирина, соответственно.
Таким образом, метод Рамановской спектроскопии может успешно применяться при исследовании конформационных изменений, вызванных взаимодействием изоферментов цитохрома P450 с лигандами или восстановлением иона железа гема.
В основе Мёссбауэровской спектроскопии лежит эффект Мёссбауэра, суть которого состоит в испускании и поглощении квантов электромагнитной энергии (гамма-квантов) ядрами в твердом теле без потери энергии на отдачу. Исследуемое вещество (поглотитель) облучается -квантами, излучаемыми Мёссбауэровскими изотопами, например, 57Fe, при этом поглотитель должен содержать такие же изотопы. Те -кванты, энергия которых совпадает с разностью энергий возбужденного и основного состояний ядер поглотителя, возбуждают ядро, поглощаясь при этом, и не попадают на детектор, в то время как кванты других частот проходят через поглотитель свободно и регистрируются детектором [157].
Мёссбауэровская спектроскопия (метод ядерного гамма-резонанса) – точный метод, позволяющий охарактеризовать электронную структуру атома железа гема во всех возможных степенях окисления. С помощью Мёссбауэровской спектроскопии проводятся измерения электрических и магнитных взаимодействий ядра атома железа с его окружением, а также анализируются спиновое состояние и степень окисления Мёссбауэровского изотопа и его структурные параметры [18]. В пионерской работе [158] по исследованию CYP101A1 с помощью Мёссбауэровской спектроскопии были определены параметры свободной и связанной с субстратом форм фермента.
Дальнейшее исследование [159] позволило выяснить, что нативный, субстрат свободный, цитохром P450 содержал ион железа в низкоспиновом состоянии, часть которого (50-70 %) переходила в высокоспиновое при взаимодействии с субстратом (камфорой), тогда как 2-фенилимидазол мало изменял Мёссбауэровский спектр. Добавление путидаредоксина (PD) к комплексу окисленного CYP101A1 с камфорой вызывало снижение интенсивности высокоспиновой компоненты и изменения в квадрупольном расщеплении. Эти данные позволили сделать вывод о том, что CYP101A1 и его комплексы являются аналогами соответствующих комплексов гемоглобина.
Таким образом, исследования отдельных аспектов каталитического цикла цитохрома P450 были выполнены с помощью Мёссбауэровской спектроскопии, однако данный метод имеет ряд ограничений, основными из которых являются включение 57Fe в гем цитохрома Р450, использование большого количества материала (около 0,5 мл раствора с концентрацией 57Fe более 0,2 мM), а также проведение эксперимента при низких температурах [18, 160].
Метод Рентгеновской спектроскопии является инструментом для исследования структуры и окислительно-восстановительных свойств металлокоординационных соединений. В частности, спектроскопия протяженной тонкой структуры Рентгеновского поглощения (EXAFS) позволяет выяснить с высокой точностью длину связи металла с лигандом, а также идентифицировать координационные атомы и их количество в металлоферментах [18, 161]. С помощью данного метода было подтверждено наличие атома серы как аксиального лиганда иона железа гема камфорного цитохрома Р450 (CYP101A1) [162]. Одной из разновидностей Рентгеновской спектроскопии, позволяющей определять угол связи Fe-O-O, изменения геометрии и электронной структуры координационной сферы железа гема, является XANES – исследование ближней тонкой структуры Рентгеновского поглощения [163].
Рентгеновская спектроскопия с достаточной точностью позволяет определять окружения иона железа гема цитохрома Р450 и его изменения [164], что важно при исследовании механизма катализа, осуществляемого монооксигеназными системами.
Электрокаталитическая активность иммобилизованных изоферментов цитохрома Р450
Цитохромы Р450 представляют значительный интерес для решения биотехнологических задач, поскольку осуществляют широкий спектр, часто с высокой регио- и/или стереоспецифичностью, химических реакций, катализируя окисление (оксифункционализацию) большого разнообразия неактивных молекул, которые могут являться прекурсорами для синтеза физиологически активных соединений [246]. Несмотря на высокий биотехнологический потенциал цитохромов Р450, в числе важнейших ограничивающих широкомасштабное биотехнологическое использование факторов можно отметить следующие [246, 247]: 1. относительно низкая, по сравнению с другими ферментами, каталитическая активность, обусловленная их физиологической ролью и сложностью каталитического цикла; 2. необходимость использования дорогостоящих коферментов НАДФН или НАДН, редокс-партнерных белков; 3. неполное сопряжение каталитического цикла и образование АФК, и, как следствие, разрушение цитохрома Р450. Эти проблемы могут быть решены с помощью электрохимических систем на основе биотехнологически значимых изоферментов цитохрома Р450. В основе принципа функционирования таких систем лежит электрохимическое восстановление гемопротеина, не требующее использования восстановительных коферментов и белковых редокс-компонентов электрон-транспортной цепи [248]. В англоязычной литературе для такого рода систем используется термин “reactor plugged to a wall socket” («реактор, подключенный к розетке») [246].
Генерируемый в процессе ферментативной цитохром Р450-зависимой электрокаталитической реакции ток регистрируется различными электрохимическими методами в зависимости от экспериментальных задач и условий проведения электрохимического анализа. Математический аппарат, описывающий функционирование различных ферментных электрохимических систем, подробно представлен в ряде фундаментальных работ [249-252].
Для характеристики электрохимических систем на основе цитохрома Р450 часто используют метод циклической вольтамперометрии. Циклическая вольтамперометрия широко используется при исследовании кинетики и термодинамики многих химических процессов. Метод заключается в том, что на изучаемую систему накладывают потенциал, линейно изменяющийся во времени, начиная с некоторой величины E0 и до E1. После этого направление развертки потенциала переключается на противоположное, и потенциал линейно изменяется до E0, на чем цикл завершается [253]. На основе анализа зависимостей потенциалов и токов пиков от скорости развертки потенциала могут быть определены важнейшие параметры окислительно-восстановительного процесса различных электрохимических систем, такие как гетерогенные константы скорости переноса электронов, или гомогенных химических реакций, сопряженных со стадией переноса заряда, а также метод циклической вольтамперометрии позволяет судить об обратимости окислительно-восстановительного процесса [254].
Для диффузионно-контролируемой обратимой электрохимической реакции восстановления и окисления вещества: Ox + w Red (1.2.) зависимость потенциала электродной реакции от активностей окисленной и восстановленной форм вещества выражается уравнением Нернста [198]: Е = Е0 + RTlnjj (1.3.) где Е потенциал электродной реакции (В), Е0 формальный потенциал электродной реакции (В), R - универсальная газовая постоянная (Дж/моль К), Т-абсолютная температура (К), а[Ox] и a[Red] - активность окисленной и восстановленной форм вещества (М), соответственно. Формальный потенциал определяется уравнением [254]: Е0 = (ра +Рс)/2 (1.4.) где Еpa - потенциал пика окисления (анодного пика) (В), Еpc - потенциал пика восстановления (катодного пика) (В).
Стоит отметить, что уравнение (1.4.) справедливо только для обратимых процессов, поэтому, в ряде случаев рекомендуется использовать термин средний потенциал или полупотенциал пиков [254].
Электрохимический анализ влияния антиоксидантных метаболических препаратов на каталитическую активность CYP3A4 и CYP2C9
Таким образом, на основе анализа циклических вольтамперограмм в анаэробных условиях показано, что иммобилизованные на ПГЭ, модифицированных ДДАБ, изоферменты цитохрома Р450 способны к обмену электронов с электродом. Как видно из таблицы 3.1.1., значения электрохимических характеристик исследуемых изоферментов цитохрома Р450 достаточно близки, что свидетельствует о схожести взаимодействия с модифицированной поверхностью электрода и протекания окислительно-восстановительных реакций. Кроме того, установлено, что при использовании ПГЭ, модифицированных ДДАБ, оптимальным количеством цитохрома Р450, используемым при иммобилизации, является 10-20 пмоль/электрод, при этом достигается максимальный процент электроактивного вещества (3-6 %). При увеличении количества иммобилизованного гемопротеина не происходит увеличения количества электроактивного вещества.
Углеродные материалы, в том числе и углеродные нанотрубки привлекают интерес исследователей при разработке электрохимических систем на основе цитохрома Р450 [267, 268]. В литературе отмечается, что функционализация электродной поверхности углеродными нанотрубками позволяет повысить чувствительность электрохимической биосенсорной системы на основе цитохрома Р450 и снизить предел определяемых концентраций, по сравнению с немодифицированным электродом [268].
В настоящей работе был проведен сравнительный анализ электрохимических и электрокаталитических свойств CYP3A4, иммобилизованного на поверхности ПГЭ, модифицированного многостеночными углеродными нанотрубками (МУНТ) или ДДАБ. Электрохимические свойства фермента, иммобилизованного на ПГЭ, модифицированном МУНТ, исследовались циклической вольтамперометрией в анаэробных условиях (рис. 3.1.2.). ПГЭ/МУНТ ПГЭ/МУНТ/С\ТЗА4 CYP3A4-Fe(II) CYP3A4-Fe(III) 2 0 Циклическая вольтамперограмма иммобилизованного 1 мкл 18,2 мкМ CYP3A4 на ПГЭ (), модифицированном 1 мкл 1 мг/мл МУНТ в хлороформе, и фоновая кривая (). Параметры измерения: скорость развертки потенциала 100 мВ/с, диапазон потенциалов от 0 до -0,8 В (отн. Ag/AgCl). Измерения проводились в 1 мл электролитного буфера, рН 7,4, насыщенного аргоном (анаэробные условия).
Из рисунка 3.1.2. видно, что циклические вольтамперограммы CYP3A4, иммобилизованного на ПГЭ, модифицированном МУНТ, в анаэробных условиях характеризуются пиками восстановления и окисления иона железа гема фермента. Стоит отметить, что при скорости развертки потенциала 100 мВ/с разность между потенциалами пиков окисления и восстановления иона железа гема CYP3A4 составила 201 ± 14 мВ, в то время как данная величина при той же скорости развертки потенциала в случае иммобилизованного CYP3A4 на ПГЭ, модифицированном ДДАБ, составила 150 ± 9 мВ. Анализ зависимостей амплитуды токов пиков восстановления и окисления иона железа гема CYP3A4 от скорости развертки потенциала выявил линейную зависимость, что свидетельствует о протекании окислительно-восстановительной реакции на поверхности электрода. В таблице 3.1.2. представлены сравнительные электрохимические характеристики CYP3A4, иммобилизованного на ПГЭ, модифицированном МУНТ или ДДАБ.
Таблица 3.1.2. Электрохимические характеристики CYP3A4, иммобилизованного на поверхности ПГЭ, модифицированного МУНТ или ДДАБ, в анаэробных условиях. Электрохимическая система Е0 (отн. Ag/AgCl), мВ с 1 Г0, моль/см2 % электроактивного белка ПГЭ/МУНТ/СУРЗА4 -348 ± 14 0,57 ± 0,04 (2,60 ± 0,58)10-10 45 ПГЭ/ДДАБ/СУРЗА4 -302 ± 10 0,51 ± 0,03 (2,73 ± 0,17)10-11 5 Приведенные данные – среднее значение ± стандартное отклонение из 3-5 независимых экспериментов.
В случае иммобилизации CYP3A4 на ПГЭ, модифицированном МУНТ, значение ks рассчитывалось по методу Лавирона при скорости развертки потенциала 100 мВ/с и Ep 200 мВ [255]. Как видно из таблицы 3.1.2., в анаэробных условиях значение полупотенциала CYP3A4, иммобилизованного на МУНТ, имеет более отрицательное значение, по сравнению с полупотенциалом CYP3A4 в случае иммобилизации на электроде с помощью ДДАБ. Это указывает на то, что иммобилизация фермента на поверхности электрода с помощью липидной пленки ДДАБ облегчает протекание электрохимического процесса. Гетерогенная константа скорости переноса электронов между электродом и ионом железа гема CYP3A4 незначительно больше при иммобилизации фермента с помощью МУНТ, по сравнению с таковым значением, рассчитанным при иммобилизации фермента с помощью ДДАБ. Обращает на себя внимание, что в случае иммобилизации фермента на электроде, модифицированном МУНТ, поверхностная концентрация электроактивного вещества на электроде более чем в 9 раз превышает это значение в случае использования ДДАБ. Дальнейший сравнительный анализ электрохимических свойств CYP3A4, иммобилизованного на ПГЭ, модифицированных МУНТ или ДДАБ, проводился в аэробных условиях. На рисунке 3.1.3. представлены циклические вольтамперограммы, зарегистрированные в аэробных условиях для CYP3A4, иммобилизованного на ПГЭ с помощью МУНТ или ДДАБ.