Содержание к диссертации
Введение 4
1. Дрожжи имеют типичную для эукариот организацию рибо сомной ДНК (обзор литературы) 7
1.1. Молекулярная организация рДНК
1.1.1. Избыточность генов рРНК
1.1.2. рДНК - тяжелая фракция дрожжевой ДНК 8
1.1.3. Гены всех типов рРНК физически сцеплены 9
1.1.4. Повторяющиеся единицы рДНК. Порядок расположения единиц 12
1.1.5. Репликация рДНК 6
1.1.6. Изменение количества рДНК 7
1.1.7. Магнификация I9
1.1.8. Амплификация 23
1.2. Генетические и цитологические аспекты рДНК 24
1.2.1. Ядрышко
1.2.2. Наследование рДНК 25
1.2.3. Ректификация 27
1.2.4. Рекомбинация внутри блока рДНК 30
2. Материалы и методы 3I
2.1. Шташлы микроорганизмов и условия культивирования
2.2. Выделение плазмидной ДНК из дрожжей ъг
2.3. Выделение хромосомной и митохондриальной ДНК
дрожжей 33
2.4. Выделение хромосомной рДНК дрожжей
2.5. Нейтральные градиенты Csci 34
2.6. Выделение общей клеточной РНК дрожжей
2.7. Введение радиоактивной метки в нуклеиновые кислоты
in vi tro 34
2.8. Синтез комплементарной радиоактивной РНК 35
2.9. Гибридизация ДНК-РНК
2.10. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции. Лигирование фрагментов ДНК
2. II. Трансформация Е. coli 37
2.12. Выделение плазмид из Е.coli
2. ІЗ. Электрофорез в агарозном геле 38
2.14. Электронная микроскопия ДНК 39
2.15. Трансформация дрожжей 40
3. Результаты 41
3.1. Выделение кольцевой ковалентно-замкнутой ДНК из штамма дрожжей 6-ІІЧІІ88
3.2. Плавучая плотность ковалентно-замкнутой ДНК из штамма 6-ІГ-ПІ88 43
3.3. Результаты электрофореза ковалентно-замкнутой ДНК из штамма 6-ПЧІІ88 м
3.4. Физическое картирование 3 мкм ДНК. Клонирование фрагментов 3 мкм ДНК 48
3.5. Молекулярная гибридизация 3 мкм ДНК с различными последовательностями дрожжевого генома 62
3.6. Электронная микроскопия препарата 3 мкм ДНК 64
3.7. Выделение 3 мкм ДНК из штамма ІГ-ЇЇІ88 71
3.8. Сравнение рестрикционных профилей хромосомной и экстрахромосомной рибосомной ДНК
3.9. Конструирование векторов на основе фрагментов 3 мкм ДНК и исследование их свойств 74
Обсуждение 79
Выводы , 89
Список литературы 9S
Введение к работе
Актуальность. Проблема организации рибосомной ДІЖ (рДНК) является существенной частью общей проблемы организации эукариотического генома. рДБК состоит из одинаковых повторшоїціїхся единиц, количество которых в геноме является видовым признаком. В пределах ввда количество рДНК монет варьировать у особей и клеточных линий. Это варьирование наблюдается не только у видов,основная часть рДЖ которых находится вне хромосомы, но и у видов с типичной хромосомной организацией рДНК. Второй случай представляет особый интерес с точки зрения сочетания жесткой (хромосомной) организации рДНК с одновременной нестабильностью числа повторяющихся единиц.
Обнаружение у дрожжей-сахаромицетов экстрахромосомной части рДНК позволяет объяснить кажущееся противоречие между хромосомной локализацией рДНК и ее потенциальной лабильностью. Экстрахромосомная рДНК дрожжей происходит от хромосомной рДНК, но относительно независима от нее благодаря способности к автономной репликации и наследованию в митозе, и может вновь встраиваться в хромосому путем гомологичной рекомбинации. Экстрахромосомная рДНК, следовательно, может обеспечивать общее изменение количества рДНК в клетке. Изучение экстрахромосомной рДНК дрожжей дает возможность глубже понять эволюционирование хромосомного и экстрахромосомного типа организации рДНК.
Цель и задачи. Целью работы был поиск новых классов экстрахромосомных ДНК дрожжей и, в случае их обнаружения, конструирование новых дрожжевых векторных молекул на их основе. Изучение новой плазмиды, обнаруженной наїли, потребовало решения следующих частных задач:
1. Получить достаточное для анализа количество чистого препарата плазмиды.
2. Изучить физико-химические характеристики плазмиды - молекулярный размер, плавучую плотность, расположение згчастков узнавания эндонуклеазами рестрикции.
3. Попытаться выяснить физиологическую роль плазмиды в клетке.
4. Сконструировать на основе новой плазмиды гибридные молекулы ДІЖ, содержащие дрожжевой селективный маркер, и изучить возможность трансформации дрожжей этими молекулами.
Научная новизна. Впервые доказано наличие у дрожжей сахаромицетов экстрахромосомной рДЖ. Обнаружен штамм с повышенным содержанием экстрахромосомной рДНК, что в сочетании с оптимизацией метода выделения дало возможность препаративно выделить экстрахромосомную рДНК. Построена рестрикцжшная карта экстрахрошсомпой ДІЖ. Проведено сравнение хромосомной и экстрахромосомной рДНК по соотношению двух вариантов повторяющихся единиц, показавшее относительную автономность экстрахромосомной рДНК. Доказана способность кольцевых молекул рДНК к автономной репликации. Определено соотношение олигомерных форм новой плазмиды. Обнаружено несколько классов кольцевых молекул дрожжевой ДНК неизвестной природы.
Практическое значение. Изучение свойств экстрахромосомной рДЖ дрожжей позволило сконструировать новый класс дрожжевых векторов для создания штаммов-продуцентов биологически активных веществ методами генной инженерии. Используя способность экстрахромосомной рДНК к автономной репликации и интеграции в хромосому,на ее основе были сконструированы векторы, трансформирующие дрожжи с высокой частотой и в то же время стабильно поддерживаемые при делениях клеток. Высокая степень гомологии рДНК разных видов предполагает возможность использования этих векторов для трансформации иных, чем сахаромицеты, промыш-ленно-важных штаммов дрожжей.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на 17 рабочем совещании по программе «Плазмида" (Тарту, 1980), на У рабочем совещании по программе нПлазмида" (Краснодар, 1981), на международном симпозиуме по молекулярной биологии дрожжей (Колд Спринг Харбор, США, 1981) и опубликованы в соответствующих материалах этих совещаний.
Объем диссертации. Работа представлена на 106 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 12 рисунков. Список литературы включает 135 наименований публикаций на русском (7) и иностранных (128) языках.