Введение к работе
Актуальность исследования
Частота встречаемости первичных опухолей мозга составляет 14,4 на 100000
человек, самыми распространенными из которых являются глиальные опухоли
[Fisher J. L., et al. 2007]. При диагностировании глиобластомы, наиболее
злокачественной морфологической формы среди всех глиом, двухлетняя
выживаемость пациентов составляет лишь 29,8 % при манифестации заболевания в
возрасте от 20 до 44 лет [Fisher J. L., et al. 2007]. При прохождении курса
химиотерапии темозоломидом и радиотерапии (суммарная доза 60 Гр.) медиана
выживаемости пациентов с данным диагнозом составляет 14,6 месяцев [Stupp R., et
al. 2005]. Клинические симптомы данного вида онкологии проявляются только на
поздних стадиях его развития, когда опухолевый очаг достигает значительного
размера. Наиболее перспективным подходом в их лечении является
диагностирование опухолей на самой ранней стадии.
Глиомы представляют собой опухоли с высоким уровнем генетической и морфологической гетерогенности. Это осложняет их диагностику на раннем этапе и при постановке первичного диагноза. Основной методикой для определения степени злокачественности глиом по рекомендациям ВОЗ служит гистологический анализ. МикроРНК – малые некодирующие РНК, которые играют важнейшую роль в регуляции транскрипционной и пост-транскрипционной регуляции экспрессии генов [Marumoto T., et al. 2012]. В опухолевой ткани происходят существенные изменения уровней экспрессии микроРНК, влияющих на различные процессы патогенеза глиом, такие как пролиферация, снижение степени апоптозов, миграция и инвазия клеток опухоли, устойчивость к химио- и радиотерапии. МикроРНК, профиль экспрессии которых подвергается значительным изменениям, могут служить новыми биомаркерами онкогенеза.
На данный момент накоплен значительный опыт по количественному определению экспрессии микроРНК в глиомах с использованием различных методов. Однако большая часть этих работ выполнена на малых выборках биологических образцов. Данные по экспрессии микроРНК нормированы относительно уровней экспрессии различных генов «домашнего хозяйства». Это осложняет интерпретацию данных и выбор микроРНК – кандидатов для диагностики глиом. В связи с этим важной задачей является стандартизация методики определения экспрессии микроРНК и выявление оптимального гена «домашнего хозяйства» для измерения экспрессии микроРНК в глиальных опухолях. Изучение влияния микроРНК на механизмы патогенеза и развития глиом также может сыграть существенную роль в усовершенствовании стандартных
методик лечения глиом и стать новым перспективным направлением в диагностике данного вида онкологических заболеваний.
Цель исследования
Количественное определение экспрессии микроРНК и генов-регуляторов
ключевых сигнальных путей в образцах глиом различной степени
злокачественности и оценка значимости данных микроРНК и генов-регуляторов в качестве потенциальных диагностических и прогностических биомаркеров развития опухоли.
Задачи исследования
-
Разработка методики количественного определения экспрессии микроРНК в биоптатах глиом при помощи ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего флуоресцентного красителя.
-
Количественное определение экспрессии 21 микроРНК и 7 генов-регуляторов ключевых сигнальных путей в образцах глиом различной степени злокачественности относительно их экспрессии в аутопсийном материале мозга и оценка парных корреляций между уровнями экспрессии данных микроРНК и генов-регуляторов.
-
Сравнительная оценка диагностических возможностей отдельных микроРНК и генов-регуляторов в качестве молекулярных биомаркеров различных степеней злокачественности глиом.
-
Количественная оценка диагностической значимости совокупности микроРНК и генов-регуляторов, обладающих наилучшим индивидуальным диагностическим потенциалом, и разработка классификатора для определения степени злокачественности глиом с использованием данной совокупности молекулярных маркеров.
-
Оценка прогностической значимости связи профилей экспрессии исследуемых микроРНК и генов-регуляторов с выживаемостью пациентов.
Научная новизна
Получены количественные профили экспрессии оригинального набора 21 микроРНК и 7 генов в биоптатах глиом. Выявлены дифференциально экспрессирующиеся микроРНК-7, -10a, -21, -23а, -137, -181а, -181b, -222 и гены MDR, ABCG2, p21 и BCL2. Впервые на основе полученных данных был создан классификатор по определению степени злокачественности глиом при помощи данного спектра микроРНК и генов. Обнаружено, что профили экспрессии трех микроРНК - микроРНК-21, микроРНК-23а и микроРНК-137, наиболее характерны
для глиом. Выявлен феномен гиперэкспрессии специфической мишени микроРНК-181b - BCL2 для всех исследованных глиом вне зависимости от степени их злокачественности и, а также отрицательная корреляционная связь между ними, что косвенно указывает на участие микроРНК-181b в процессах регуляции апоптоза в клетках глиом. Показана достоверная корреляция повышенной экспрессии микроРНК-21 с резким снижением выживаемости пациентов с глиомами.
Практическая значимость работы
Создана система для диагностирования глиом при помощи комплексной оценки уровней экспрессии микроРНК (-7, -10a, -21, -23а, -137, -181а, -181b, -222) и генов-регуляторов (MDR1, ABCG2, p21 и BCL2) с чувствительностью 98,4% и специфичностью 87,2% при точности 96,4%. Применение разработанного классификатора для диагностирования степени злокачественности глиом позволяет определять ее с точностью 69,5%. Разработана система из трех наиболее информативных маркеров: микроРНК-21, микроРНК-23а, микроРНК-137, которая позволяет достоверно различать группы глиом всех степеней злокачественности между собой. Выявление указанных информативных маркеров упрощает диагностическую систему и определяет перспективы создания неинвазивных тест-систем для диагностики и классификации глиальных опухолей. Разработаны прогностические критерии исхода патологического процесса на основе определения уровня экспрессии микроРНК-21. В результате исследования созданы предпосылки для разработки неинвазивных скрининговых тест-систем на основе определения экспрессии микроРНК в крови.
Личное участие автора в получении результатов
Автором выполнены все этапы молекулярно-генетических исследований,
статистическая обработка полученных данных и теоретическое обобщения
полученных результатов. Биологический материал и результаты его
гистологических исследований были любезно предоставлены сотрудниками
Федерального государственного автономного учреждения «Научно-
исследовательский институт нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Положения, выносимые на защиту
1. Создана система, позволяющая диагностировать глиальные опухоли с
чувствительностью 98,4% и специфичностью 87,2% при точности 96,4%,
основанная на количественном определении экспрессии оригинального набора
микроРНК и генов (микроРНК-7, -10a, -21, -23а, -137, -181а, -181b, -222, гены MDR1,
ABCG2, p21 и BCL2) в биоптатах глиом.
-
Построен классификатор степени злокачественности глиом на основе разработанной системы маркеров, позволяющий диагностировать степень злокачественности глиом с точностью 69,5%.
-
Наиболее информативные маркеры: микроРНК-21, микроРНК-23а и микроРНК-137 позволяют диагностировать глиальные опухоли с чувствительностью 95,7%, специфичностью 80,4% и с точностью 93,2%.
-
Феномен гиперэкспрессии специфической мишени микроРНК-181b -BCL2 для всех исследованных глиом и отрицательная корреляционная связь между ними косвенно указывает на участие микроРНК-181b в процессах регуляции апоптоза в клетках глиом.
-
Повышенная экспрессия микроРНК-21 (КР 1,193; 95% ДИ 1,035-1,374) и более старший возраст пациентов (КР 1,075; 95% ДИ 1,041-1,110) достоверно коррелируют со снижением выживаемости пациентов с глиомами, что позволяет рекомендовать их в виде прогностических критериев исхода патологического процесса.
Внедрение результатов исследования
Результаты диссертационной работы были внедрены в научно-
исследовательскую, практическую и педагогическую деятельность Федерального государственного автономного учреждения «Научно-исследовательский институт нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Апробация результатов исследования
Основные материалы работы были представлены на IX Международной (XVIII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 16 мая 2014 г.); X Международной (XIX Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 19 марта 2015 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 2 статьи в рецензируемых отечественных журналах и 1 статья в международном журнале, 2 тезисов в сборниках научных работ на конференциях.
Объём и структура работы
Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из следующих глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты,
обсуждение, выводы, список литературы, благодарности. Список литературы содержит 260 источников. Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и 15 таблицами.
Материалы и методы
Биологический материал. Образцы опухолей были получены от пациентов, проходивших хирургическое лечение в Федеральном государственном автономном учреждении «Научно-исследовательский институт нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации. в 2012-2014 г.г. Все пациенты подписали информированное согласие на проведение операции и использование части ткани опухоли для постановки диагноза.
Табл. 1. Клинико-морфологическая характеристика образцов ткани глиом
Возраст, лет
Общее число пациентов в группах
по степени злокачественности
опухоли
Общее число пациентов в группах
по степени дифференцировки
опухоли
Общее число пациентов в группах
по результатам гистологического
диагноза опухоли
Все образцы тканей представлены первичными опухолями, не
подвергавшимся химио- и радиотерапии. Гистологический диагноз устанавливался при помощи классификации ВОЗ в патологоанатомическом отделении
Федерального государственного автономного учреждения «Научно-
исследовательский институт нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко»
Министерства здравоохранения Российской Федерации. В Табл. 1. представлена их
морфологическая характеристика. В качестве контрольного материала
использовались 25 образцов аутопсии мозга. Ткань забирали спустя 7-10 часов после наступления смерти. Образцы были получены из правого и левого полушария от 12 пациентов, не страдавших какими-либо онкологическими/неонкологическими заболеваниями центральной нервной системы.
Сбор и консервация биологического материала. Образцы опухолевой ткани сразу после иссечения измельчали и помещали в стерильные центрифужные пробирки емкостью 15 мл («Corning», США), содержащие 3 мл буфера RNAlater RNA Stabilization Reagent («Qiagen», Германия). Затем пробирки с образцами были помещены в холодильник, где при температуре +4 оС они хранились от 1 до 7 дней. Далее буфер сливали, а образец помещали в криопробирки объемом 1,2 мл («Corning», США) и замораживали при температуре -70 – -80 оС.
Выделение суммарной (тотальной) РНК. Образцы опухолевой ткани измельчали в лабораторном гомогенизаторе TissueLyser LT («Qiagen», Германия) в 700 мкл QIAzol Lysis Reagent («Qiagen», Германия) в пробирке объемом 2 мл («Qiagen», Германия) по протоколу, предоставленному производителем. Выделение тотальной РНК из водной фазы проводили при помощи хроматографических колонок miRNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия) по протоколу производителя.
Определение концентрации РНК в водном растворе. Водный раствор суммарной РНК оценивали на спектрофотометре NanoVue Plus («GE Healthcare», Великобритания). Спектры поглощения полученного раствора определяли при трех длинах волн (230, 260, 280 нм). В исследование отбирали образцы при отношении поглощения при 260/280 нм равное 2 (1,9-2,1) и при отношении поглощения при 260/230 нм более 2 (2-2,3). Далее качество суммарной РНК проверяли при помощи электрофореза в агарозном геле в нативных условиях по интенсивности полос 28S и 18S рРНК.
Обработка суммарной РНК дезоксирибонуклеазой I. Образцы суммарной
РНК в количестве 1000 нг обрабатывали DNase I, RNase-free (1 ед/мкл) («Fermentas»,
Литва). В исследовании экспрессии микроРНК обработку дезоксирибонуклеазой I
не применяли, так как универсальный праймер был подобран таким образом, что он
не отжигается на геномной ДНК человека. Верификация была выполнена с помощью
онлайн-сервиса для выявления специфичности продукта ПЦР
.
Синтез первой цепи кДНК и полиаденилирование суммарной РНК.
Синтез первой цепи кДНК проводили с использованием набора MMLV RT kit
(«Евроген», Россия) по протоколу производителя. Количество РНК-матрицы
составляло 1000 нг для дальнейшего исследования экспрессии генов-мишеней. В
качестве праймеров использовали 2 мкл случайных декануклеотидных праймеров.
Для оценки экспрессии микроРНК (500 нг РНК-матрицы) одновременно с синтезом
первой цепи кДНК проводили реакцию полиаденилирования, добавляя 3 ед. E. coli
Poly(A) Polymerase («New England Biolabs», Великобритания) и вместо случайных
декануклеотидных праймеров использовали праймер-адаптер 5’-
GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTVN-3’, где V – G, A или C; N – G, A, T, или C [Shi R., et al. 2005].
Полимеразная цепная реакция «в реальном времени». Постановку ПЦР «в реальном времени» проводили при помощи амплификатора StepOnePlus («Applied Biosystems», США) с использованием флуоресцентного интеркалирующего красителя SYBR Green I. Нуклеотидные последовательности микроРНК были получены с сайта mirBASE , последовательности генов-мишеней - с сайта NCBI (). Последовательности праймеров подбирали с использованием программы Beacon Designer 7 («Premier Biosoft International», США). Перед постановкой ПЦР «в реальном времени» кДНК-библиотеку для оценки экспрессии генов-мишеней разводили, добавляя к смеси 100 мкл воды, свободной от РНКаз и ДНКаз. Для анализа микроРНК кДНК-библиотеку, разводили в 200 мкл воды. ПЦР проводили в конечном объеме 10 мкл, используя 1 мкл исследуемой кДНК-библиотеки. Для детекции микроРНК использовали универсальный праймер – GCGAGCACAGAATTAATACGAC. В качестве гена «домашнего хозяйства» была выбрана микроРНК-191. При постановке ПЦР «в реальном времени» использовали готовую смесь для ПЦР qPCRmix-HS SYBR+ROX («Евроген», Россия). ПЦР проводили при следующих условиях: первичная денатурация - 95С/5 минут; затем 40 циклов, каждый из которых включал в себя стадию денатурации - 94С/15 секунд, отжиг - 56С/30 секунд и элонгацию - 70С/30 секунд. При постановке ПЦР для определения экспрессии генов-мишеней в качестве гена «домашнего хозяйства» был выбран ген TBP. ПЦР проводили при следующих условиях: первичная денатурация - 95С/5 минут; далее 40 циклов, из которых каждый цикл включал денатурацию - 94С/20 секунд и отжиг - 59С/30 секунд. Все реакции ставили в трех повторах. Каждый эксперимент повторяли дважды.
Анализ экспрессии микроРНК и генов-мишеней, расчёт эффективности и специфичности реакций, статистический анализ полученных данных.
Относительный уровень экспрессии микроРНК рассчитывали методом Сt [Livak K. J., et al. 2001]. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ R версии 3.02 (). Сначала выявляли статистическую значимость зависимости уровня экспрессии, выраженного в -Ct,
от уровня злокачественности для каждой молекулы-мишени. Далее применяли непараметрический критерий Краскела-Уоллиса, который предназначен для оценки различий одновременно между тремя, четырьмя и т. д. выборками по уровню какого-либо признака. Для коррекции полученных значений p использовали поправку на множественные сравнения Бенджамини-Хохберга. Значения p обозначались q при использовании поправок по типу FDR.
На втором этапе статистической обработки для молекул-мишеней, уровень экспрессии которых значимо зависел от уровня злокачественности с учетом поправки Бенджамини-Хохберга, проводили попарное сравнение уровня экспрессии во всех исследуемых группах с помощью критерия Манна-Уитни. Среди всех полученных пар групп отбирали значимо различающиеся с применением поправки Бенджамини-Хохберга. Для расчёта чувствительности и специфичности реакций использовали ROC-кривые с подсчетом коэффициента Йоудена, построенные с использованием пакета pROC для R. Для определения возрастания и убывания экспрессии в экспериментальных группах, ранжировали значения, полученные в контрольной группе. Потом рассчитывали среднее между первым значением и вторым значением с одной и, с другой стороны. Эти значения были определены как границы изменения экспрессии. Далее мы использовали 2.08 и 97.92 перцентили в каждой из контрольных групп. Для микроРНК-21 была рассчитана граница, равная 1,371 –Сt. Это было необходимо, чтобы получить значение, относительно которого пациентов можно разделить на группы с высокими и низкими уровнями экспрессии микроРНК-21.
На третьем этапе рассчитывали коэффициенты корреляции между уровнями экспрессии молекул-мишеней по методу Спирмена. Статистическую значимость коэффициентов корреляции рассчитывали с применением алгоритма AS 89.
На четвертом этапе строили вероятностные классификаторы. Построение классификатора «random forest» для четырех групп (I-II, III, IV степени злокачественности и контроль) и двух групп (образцы глиом и контроль) данного исследования проводили с использованием модуля randomForest в статистическом пакете R. Для проверки результатов классификатора использовался подход кросс-валидации со случайными подвыборками. 5000 раз осуществлялась следующая процедура: программа выбирала случайную подвыборку из 10 образцов и проводила обучение классификатора по всем образцам, кроме них. Затем проводилось предсказание отношения образца к одной из исследуемых групп по данной подвыборке из 10 образцов.
На пятом этапе строили кривые выживаемости Каплана-Мейера, после чего оценивали взаимосвязь выживаемости пациентов и экспрессии молекул-мишеней при помощи регрессионного анализа Кокса. Среди всех исследуемых мишеней
проводился поиск возможных предикторов с учетом поправки Бенджамини-Хохберга. В дальнейшем проводили оценку пропорциональных рисков по тем мишеням, которые статистически достоверно были связаны с выживаемостью.