Экспрессия, локализация и фосфорилирование изоформ киназы легких цепей миозина в клетках животных и человека Чибалина, Маргарита Валериевна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Киназа легких цепей миозина (КЛЦМ) является ключевым регулятором клеточной подвижности, опосредуемой миозином П-го типа (Stull et al., 1986). КЛЦМ активируется комплексом Са²^-кальмодулин и фосфорилирует регуляторные легкие цепи (РЛЦ) миозина. Фосфорилирование РЛЦ на несколько порядков увеличивает активность актии-активируемой Mg²*-зависимой АТФазы гладкомышечного и немышечного миозинов (Adelstein andConti, 1975; Sellers, 1985) и запускает сокращение гладкомышечных клеток. В немытечных клетках фосфорилирование РЛЦ миозина киназой легких цепей миозина определяет множество форм клеточной активности. Показано, что КЛЦМ регулирует ретракцию эндотелиальных клеток и сокращение фибробластов (Wysolmerski and Lagunoff, 1990, 1991; Kolodney and Wysolmerski, 1992), афегацию и ретракцию тромбоцитов (Lokeshwar and Bourguignon, 1992; Hashimoto et al., 1994), быстрое амебоидного движение эукариотических клеток, таких как макрофаги и эозинофилы (Wilson et al., 1991; Walker et al., 1998). Известно, что КЛЦМ также вовлечена в регуляцию цитокинеза (Fishkind et al., 1991; Yamakita et al., 1994; Matsumura et al., 1998), подвижности конуса роста нервных клеток (Jian et al., 1994, 1996), секреции (Choi et al., 1994; Park et al., 1996; Rao et al., 1997; Kim et al., 1998), "кэпирования" рецепторов на поверхности клеток (Kerrick and Bourguignon, 1984; Majercik and Bourguignon, 1988), образования пузырчатых вздутий на мембранах апоптотических клеток (Mills et al.. 1998).

Генетический локус гладкомышечной/немьипечной КЛЦМ позвоночных имеет сложную организацию. Он кодирует три продукта: классическую КЛЦМ, молекулярная масса которой составляет 108 кДа, высокомолекулярную изоформу КЛЦМ с молекулярной массой 210 кДа и белок KRP (Kinase Related Protein) (Olson et al, 1990; Collinge et al., 1992; Watterson et al. 1995). КЛЦМ-210 включает в себя всю последовательность и все функциональные домены КЛЦМ-108 и дополнительно содержит еше протяженную N-концевуто последовательность, которая отсутствует у КЛЦМ-108 (Watterson et al., 1995). KRP представляет собой белок, ішентичньїй по аминокислотной последовательности С-концевому домену КЛЦМ. Он экспрессируется с собственного промотора, который находится внутри нитрона КЛЦМ (Gallagher and Herring, 1991; Collinge et al., 1992). Устройство по типу ген в гене, показанное для генетического локуса КЛЦМ, явилось первым примером подобной организации в геноме эукариот. Несмотря на то, что установлена полная экзон-интронная структура гена КЛЦМ в геноме птиц, молекулярно-генетические отношения двух изоформ КЛЦМ на сегодняшний день остаются невыясненными. Не понятно, являются ли они продуктами альтернативного сплайсинга или их экспрессия инициируется с независимых промоторов.

Свойства высокомолекулярной изоформы КЛЦМ изучены очень мало. Известно лишь, что КЛЦМ-210 тоже является протеникиназой и фосфорилирует тот же субстрат, что и КЛЦМ-108 - РЛЦ миозина П-го типа (Gallagher et al., 1995). К началу данного исследования высокомолекулярная изоформа КЛЦМ считалась эмбриональной изоформой КЛЦМ (Gallagher et al., 1995; Fisher and Ikebe, 1995). Однако недавно было показано, что высокомолекулярная изоформа экспрессируется в эндотелиальных клетках взрослого организма (Garcia et al., 1997). В то же время вігутриклеточное и тканевое распределение этого белка остается неизученным. Не ясно, в чем заключаются функциональные различия двух изоформ КЛЦМ. Несмотря

на то, что структура гена КЛЦМ известна, никакие регуляторные единицы пока не найдены и не понятно, как регулируется экспрессия этих белков в тканях и в процессе онтогенеза.

Целью настоящей работы являлось изучение локализации, экспрессии и посттрансляционных модификаций продуктов генетического локуса кииазы легких цепей миозина в клетках позвоночных. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить локализацию изоформ КЛЦМ в тканях и их экспрессию в культивируемых
гладкомышечных клетках.

1. Установить внутриклеточное распределение КЛЦМ-210 и роль ее уникальной последовательности во взаимодействии с цитоскелетом.

2. Исследовать фосфорилирование КЛЦМ в культивируемых гладкомышечных клетках.

Научная новизна работы. Показано, что высокомолекулярная изоформа КЛЦМ экспрессируется преимущественно в немышечных тканях, а также в гладких мышцах аорты. Впервые исследована локализация высокомолекулярной изоформы КЛЦМ в тканях. КЛЦМ-210 обнаружена в некоторых типах эпителия (эпителии трахеи и яйцевода, эндотелии сосудов). Высказано предположение, что КЛЦМ-210 может участвовать в регуляции специфических форм клеточной подвижности, таких как секреция и эндоцитоз. Впервые продемонстрировано, что КЛЦМ-210 колокализуется с мнкрофиламентами в гладкомышечных клетках аорты и в немышечных клетках. С помощью двух альтернативных методов (окрашивания цитоскелетов клеток флуоресцентно-меченными белками и трансфекшш клеток молекудярно-генегаческнми конструкциями) показано, что уникальный фрагмент КЛЦМ-210 связывается с мнкрофиламентами в клетках. Полученные результаты по дифференциальной экстракции и ингибированию КЛЦМ в культивируемых клетках позволяют предположить, что КЛЦМ-210 вовлечена в стабилизацию актинового цитоскелега клеток. Впервые показано, что экспрессия высокомолекулярной изоформы КЛЦМ в гладкомышечных клетках регулируется механическими и гуморальными воздействиями. Установлено, что обе изоформы КЛЦМ в культивируемых ГМК являются фосфобелками. Показано, что р42 МАР-киназа является основной протеинкиназой, фосфорилиругащей КЛЦМ при стимуляции ГМК форболовым эфиром.

Практическая значимость работы. Результаты работы создают предпосылки для дальнейших исследований организации генетического локуса КЛЦМ животных и человека и установлению функциональных особенностей его множественных продуктов. Полученные антитела, молекулярко-генетические конструкции и разработанные методические подходы могут быть использованы в широком спектре исследований механизмов клеточной подвижности.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийской конференции "Прикладные аспекты исследования скелетных, сердечных и гладких мышц", (Пущине, Россия, 1996), на 8-ом Европейском симпозиуме по изучению гипертонии (Милан, Италия, 1997), на 2-ом и 4-ом совещаниях стипендиатов Медицинского Института Говарда Хьюза (Варшава, Польша, 1997; Москва, Россия, 1999), на международном симпозиуме "Биологическая подвижность: современные методы исследования" (Пушино, Россия, 1998), на съезде

Американскою Биофизического общества (Канзас-Сити, США, 1998), на 27-ой и 28-ой Европейских мышечных конференциях (Лунд, Швеция, 1998; Йорк, Великобритания, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована I таблицей и 37 рисунками. Список литературы включает 205 источников.