Введение к работе
Актуальность проблемы. Хлоропласта - специфические органел-
лы растительной клетки, являются центрами фотосинтетической дея
тельности растений. В геноме хлоропластов идентифицированы около
100 генов. Показано, что они кодируют белки аппаратов транскрип
ции и трансляции, а также белки, принимающие участие в фотоспн -
тазе. С геномом хлоропластов связаны хозяйственно ценные призна
ки растений, такие как устойчивость к неблагоприятный факторам
внешней среды, некоторым антибиотикам, гербицидам, грибным пато
генам. '. . . .
В последние годы достигнуты большие успехи в изучении структуры генома хлоропластов. Установлена полная нуклеотидная последовательность геномов хлоропластов трех видов высших растений: табака, риса и печеночного мха иаг-chantia . Цросеквенирована значительная часть геномоз хлоропластов еще нескольких видов высших растений и водорослей.
В настоящее время все большее внимание удаляется исследованию вопросов функционирования этого клеточного генома, координации экспрессии хлоропластных генов и ядерных генов, кодирующих белки хлоропластов, а также регуляторних механизмов, контролирующих эти процессы.
В этой связи большое значение приобретает разработка модельных систем для изучения транскрипции хлоропластных генов и её регуляции. Одна из таких систем предполагает выделение из хлоропластов транскрипциоино-активных ДНК-белковых комплексов. Такая система не требует солюбилиза'ции и очистки РНК-полимераэV регуляторних молекул и ДНК-матриц Для опытов по реконструкции. Преимущество использования изолированных ДЕЖ-белковых комплексов хлоропластов при исследовании транскрипции состоит в том, что эта система'.'максимально приближается к интактной клетке.
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования явилась характеристика изолированного ЯНК-белкового кошлекса (нук-лаоидов) хлоропластов Azoiia pinnata .изучение возможности использования этой модельной системы для исследования экспрессии хлоропластных генов.
Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:
-усовершенствовать метод выделения очишенных ингактных хлоропластов из клеток папоротника Azolla pinnata;
выделить транскртационно-активный ДНК-белковый комплекс из очищенных хлоропластов;
изучить химический состав, физико-химические свойства и структуру изолированного комплекса;
определить функциональную (транскрипционную) активность изолированного ДНК-белкового комплекса;
провести анализ полипоптидного состава ДНК-белколого комплекса хлоропластов a. pinnata и сравнить ого с полипептидным составом других компартиюнтов пластид;
попытаться обнаружить к идентифицировать белки основного характера в состава, ДИК-белкового комплекса хлоропластов
A.pinnata ;
- определить оптимальные условия функционирования указанной
модельной системы и идентифицировать РЖ-транскрипты.
Azolla pinnata , как объект исследования, биохимически мало изучена и представляет интерес с эволюционной точки зрения. Кроме того,этот папоротник имеет, народно-хозяйственное значение, что определяется его способностью связывать атмосферный азот и химическим составом его биомассы.
Научная новизна исследования. Впервые выделен ДЖ-белко-вы2 комплекс из хлоропластов папоротника ,\. pinnata при помощи гель-фильтрации на сефарозе <Щ. Изучены химический состав, некоторые физико-химические свойства и тонкая структура изолированного комплекса. Электрофоре типе скш сравнением полипептидно-го состава ДНК-белкового комплекса, растворимой и мембранной" фракций хлоропластов показано, что компонентний состав полипептидов ДНК-белкового комплекса слоциюпчон. Обнаружены 9 полипвп-тидов, которые входят в состав комплекса и не встречаются в других компартментах пластид. В составе изолированного ДНК-белново-го кошлекса из хлоропластов папоротника д. pinnata . имеются два белка основного характера, по размеру'и электрофоретической подвижности гомологичные пістонам H2A+IK.J и ИЗ зародышей пшеницы. Изучена функциональная (транскрипционная) активность ДНК-белкового комплекса. Впервые выявлены оптимальные условия функционирования этой системи. Ипептифщкроланн некоторые ИК-транс-крипты, синтезируемые, изолированным ДНК-белковым комплексом из
хлорсюяастоа. папоротника a. pinnate . Показано, что прочно связанная о ДНК РЙК-полшераза комплекса считывает гены рРНК.
Практическая значимость исследования. Работа имеет теоретическое значение и вносит вклад в изучение модельных систем для исследования экспрессии хлороплаотных генов. Относительная простота модели и её приближенность к интактноЗ клетке позволяют яэу-чать экспрессию генов, определяющих фатосинтетическую активность растений, в условиях максимально близких к условиях in vivo, что в перспективе позволит создать лучшие формы растений с являемым сочетанием признаков.
Апробация работы. Материалы по теш диссертации были представлены на:8-м Международном конгрессе по фотосинтезу в Швеции (Стокгольм, 6-II авг.1989); Международных симпозиумах (Варшава, 1989; Москва,1989); Советско-индийском симпозиуме (Пущиио-на-Окв, 1990); Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосинтезируших системах и моделях" (Пущішо-на-0ке,І989).
Публика иди. По теме диссертации опубликованы 6 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа сос
тоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов
исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения,
заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссер
тационная работа изложена на страницах 'Машинописного текста,
содержит 6 таблиц и 25 рисунков'. Список цитируемой литературы
включает наименований, из которых на иностранных язы-