Введение к работе
I. Актуальность темы, В условиях непрерывного сокращения биоло-ических ресурсов резко растет их стоимость и возникает актуаль-ая проблема более полного их использования с наименьшими затра-ами, особенно дорогих биопрепаратов и реагентов, в своей работе і попытались решить проблему управления реактивностью живых сис-эм воздействием разнообразных стимуляторов с целью уменьшения зз биологически активных веществ / митогенов и цитостатиков /, зпорения пролиферации культур клеток используемых в биотехноло-ли, а также увеличения выхода интерферона / ИФН /.
Изучение стимуляции ростовых процессов и синтеза практичес- . л важных метаболитов постоянно привлекает внимание ученых и прак-яков. Этому посвящены работы Калинина Ф.М. / 19а4 /, Ситковско-) В.М. / I9V9 /, ГЪрлиной Н.К. с соавт. / 1985 /, Раппопорта И.А.
І9&) /, Кузнецова В.П. / І9аІ,І983 /, Ермольевой З.В. с соавт.
1970 /, Ранчялиса В.П. / I973;I97b / и многих других авторов. 5пекты раздельного и совместного влияния стимуляторов различной гиологии, а также механизм этого воздействия на клеточные куль-Гра практически не изучены. Из обширной группы стимуляторов хи-таеской и биологической этиологии наші были выбраны хорошо изу-знныо на других объектах стимуляторы, в основе действия боль -інства из которых лежит изменение проницаемости мембран: кошса-шалин А / Кон А /, фитогемагглютинин / ФГА / и ряд других. гх показано в работах Журавлева А.И. / I9bU /, Керра, Дата и ?шари с соавторами І'/^ЄГГр.С.ЄІ.аЕ,/9&9; DunnR,i9bS; S/iQ/71-ЮГІ Tfl.Q.Pt.UC;/990/, фактором физической природы, действующим ї мембранную проницаемость, является ультразвук / УЗ /. Влияние З в качестве стимулятора ростовых процессов клеточных культур ж индивидуально, так и совместно с другими агентами до нашей іботн практически не изучалось. УЗ также на был никем использо-ui для увеличения выхода ИФН.
Разработка нестандартных, экономически выгодных методов по-взвнил продукции ИФН позволит расширить сферу его .использования
более успешно применять как при лечении и экстренной профилакти-) вирусных инфекций, тал и в качестве иммунокорректора, нормали-гпцего иммунный статус животных.
Цель и задачи исследований. Цель, которая преследовалась при ютановке данной работы - подобрать и найти оптимальный режим їздойствия УЗ и других агентов для стимуляции пролиферативной ак-івности перевиваемой культуры клеток почки теленка itlDBRi и
стимуляции продукции ИФН; изучить стимуляции иммунного статуса при введении ишуномодуляторов.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи: I/ изучить рост и люминесценцию светящихся бактерий V. (f-JC&OnerL , взятых в качестве модельного объекта,в ответ на воз действие различных доз стимуляторов; 2/ изучить стиыуляторный эф фект различных агентов на пролиферацию культуры клетокJiDBH; 3/ изучить действие УЗ на продукцию ИФН-а лейкоцитами. Сравнить ііммуномодулирующий эффект полученного ИФН и Т- и В- активинов на повышение иммунного статуса гнотобиотических морских свинок; 4/ разработать и внести конструктивные изменения в методику очистки и проверки ИФН; 5/ отработать методику выделения иммуноглобулино сыворотки крови морской свинки для получения видоспецифических а тисывороток.
Научная новизна работы. Впервые на культурах клеток V. Jl$cf}6ri и лейкоцитов показано стимулирующее действие УЗ в самостоятельного фактора, так и совместно с биологически активны веществами. Благодаря увеличению проницаемости мембран клеток,УЗ индивидуально и в сочетании с другими стимуляторами интенсифицир ет процессы метаболизма, пролиферацию клеток, проникновение энзо генных / митогенн, цитостатики и др./ и эндогенных / ИФН / вещее через клеточную стенку. Биохимическими методами подтверждена пол ценность, отсутствие токсичности и иммуномодулирующее действие п лученного ИФН.
Новым в работе является нахождение способа получения культу клеток с применением указанных стимуляторов, а также способа пол чения ИФН. Приоритетный характер данных исследований и разработо подтверждены положительным решением Госкомизобретений СССР № 157 от 1.3.90 г. и Р 1597387 от 8.6.90 г. на выдачу авторских свидет как имеющих абсолютную новизну и практическую значимость.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученный эф фект увеличения проницаемости мембран живых клеток под влиянием является ключевым в понимании механизма его действия на кивые ор низмы. Биохимическая и клиническая полноценность дополнительно п ченных препаратов показывает отсутствие разрушительного, денатур рупцего действия применяемых интенсивностей. Для гнотобиотов - ы ких свинок установлены уровни содержашя сывороточных белков, чте f*T возможность изучать имыуномодулирупцее действие препаратов и организм животных.
Способы получения ИФН и культур клеток животных с использов
[ем эффекта изменения проницаемости клеточных мембран под дейст-іеи УЗ позволяют существенно увеличить выход ИФН и значительно побить индекс пролиферации.
Экспериментально отработана методика нахождения режимов воздей-вия на клетки физических факторов на примере действия УЗ на све-щиеся бактерии.
Предложен экономически обоснованный метод уменьшения в 10 раз нцентрации митогенов в процессе стимуляции размножения клеток в льтуре за счет воздействия оптимальными режимами УЗ.
В работе показана принципиальная возможность использования ьтраконцентрирования при получении ИФН, что позволит исключить Д трудоемких операций из технологического процесса.
Научные результаты внедрены на кафедрах органической и биоло-чоской химии и биофизики и физики при чтении лекций по темам: Биохимические основы иммунитета ", " Биохимия крови ", " Биохе-пюмннесценция " и " Биофизика клетки ". Результаты диссертацион-й работы использованы в методических указаниях п Разделение и истка иммуноглобулинов сыворотки крови морской свинки и получе-э «специфических антисывороток ". М., MtSA, 1994.
Полученные результаты открывают перспективу целенаправленного гпериментального поиска возможности использования факторов биоло-іеской и физической природы для стимулирования биотехнологичес-с процессов с участием клеток различной этиологии.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
мадывались на: Всесоюзном симпозиуме с международным участием
Ірименение ультразвука в промышленности и медицине ", Вильнюс,
37, 1988; Всесоюзной конференции " Ультразвук в сельском хозлй-
їє ", Рязань, I98V; Научных конференциях МВА, Москва, 1987,1988;
юоюзном симпозиуме " Акустическая кавитация и проблемы интенси-
сации технологических процессов ", Одесса, 1989; Пятой националь-
\ конференции по биомедицинской физике и инженерии, Болгария, Со-
[, 1989; на меккафедральком и кафедральных совещаниях сотрудни-
I МВА / 1986 - 1994 /. . .
Структура и объем диссертации, .фссертационная работа состоит введения, обзора литературы, собственных исследований, обсужде-[, выводов, сведений о практическом использовании результатов ледований, рекомендаций по использованию научных выводов, спис-литературы, включающего 334 источников, в том числе j^j иност-ных, приложения. Работа изложена на 194 страницах машинописно-текста, содержит 14 таблиц, 30 рисунков и < фотографий.