Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из актуальнейших задач современной биологии на сегодняшний день является изучение структурных перестроек хроматина и их связи с функциональным состоянием клетки. Решение этой задачи позволит разработать подходы к регуляции процессов, происходящих в клетке, в частности, к регуляции процесса транскрипции. Олигодезоксирибонуклеотиды и их производные являются уникальными инструментами для исследования структурно-функциональной организации хроматина.
Использование производных олигонуклеотидов для направленной
модификации нуклеиновых кислот было предложено более 30 лет тому
назад Н.И. Гриневой [Belikova et al., 1967]. В 80-х - 90-х гг были
проведены первые эксперименты по изучению взаимодействия
производных олигонуклеотидов с хроматином. Было показано, что
производные дезоксирибоолигонуклеотидов связываются с
комплементарными расплетенными участками ДНК в хроматине и
модифицируют как ДНК, так и близлежащие белки [Власов с соавт., 1985;
Kobets et al., 1994]. Результаты аффинной модификации хроматина
свидетельствовали о перспективности использования
реакционноспособных производных олигонуклеотидов для изучения структуры хроматина, в частности, для локализации одноцепочечных участков ДНК в клеточном ядре и выявления возможных причин их появления.
Одной из задач установления структуры хроматина в составе ядра является определение топографии расплетенных участков ДНК. Ранее в нашем институте был синтезирован ряд аффинных сорбентов, несущих иммобилизованные короткие олигонуклеотиды, и было показано, что белки, в частности, эндонуклеазы рестрикции, специфично связываются с иммобилизованными на полимерах короткими олигонуклеотидами, содержащими сайты связывания этих ферментов [Дегтярев с соавт., 1989]. Сочетание методов аффинной модификации хроматина с последующим анализом модифицированных белков гель-электрофорезом и аффинной сорбции ядерных белков на полимерах с иммобилизованными олигонуклеотидами позволило бы получить более полную информацию о ДНК-белковых взаимодействиях в хроматине в участках локального расплетения ДНК.
Цель и задачи работы. Целью данной работы является локализация одноцепочечных участков ДНК в хроматине и изучение белкового окружения расплетенных повторяющихся последовательностей ДНК с помощью производных олигонуклеотидов и олигонуклеотидов, иммобилизованных на полимерах. В ходе работы решались следующие задачи:
1) разработка метода локализации расплетенных
последовательностей ДНК в хроматине клеток млекопитающих,
доступных для модификации производными олигонуклеотидов,
направленными на эти последовательности, с помощью люминесцентной
и электронной микроскопии;
2) изучение модификации хроматина клеток HeLa вблизи d(GT)n-
повторов производными рё(АС)6, несущими на 5'-конце остаток 2-
хлорэтилариламина или (нитро)арилазида, в условиях, индуцирующих
переход ДНК из В- в Z-форму, анализ распределения в хроматине
участков В->2-nepexoAa ДНК и выявление вклада таких переходов в
появление одноцепочечных участков ДНК в хроматине;
3) изучение фотомодификации белков хроматина, входящих в
окружение d(GT)n-noBTOpoB, пара-азидоанилидным производным
pd(AC)6; выявление белков хроматина, потенциально способных к
связыванию с ё(ОТ)п-блоками ДНК в хроматине, с помощью аффинной
сорбции и сравнение белков, имеющих сродство к (ІЮТь-блoкaм, с
белками, специфично модифицирующимися в окрестностях расплетенных
участков d(GT)n-6noKOB.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей
диссертационной работе впервые предложен и разработан метод,
позволяющий локализовать расплетенные последовательности ДНК в
нативном хроматине, используя производные олигонуклеотидов.
Проведено сравнение распределения расплетенных
полидезоксирибоадениловых последовательностей в составе
интерфазных ядер и метафазных хромосом. Изучена аффинная модификация хроматина в условиях реализации перехода ДНК из В- в Z-форму. Показано, что B->Z-переходы ДНК являются одной из вероятных причин появления в хроматине одноцепочечных участков. Изучена аффинная модификация хроматина в области d(GT)n-noBTopoB ДНК. Показано, что набор белков, специфично модифицируемых вблизи этих последовательностей, определяется только олигонуклеотидным адресом (pd(AC)6) и не зависит от природы реакционноспособной группы (алкилирующая, фотореакционноспособные). С помощью метода аффинной сорбции получен набор белков хроматина, имеющих сродство к (СТ)„-блокам ДНК. Обнаружено перекрывание наборов сорбируемых и специфично модифицируемых белков Сделано предположение о топографии расплетенных участков (ОТуповторов ДНК в ядре.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты работы были доложены на 6 международных конференциях: 20-ом ежегодном симпозиуме ЕМВО "Genome and Chromosomes" (Гейдельберг, Германия, 1994), русско-французском симпозиуме "Regulation of Gene Expression" (Новосибирск, Россия, 1995), конгрессе "Congress on Therapeutic Oligonucleotides" (Рим, Италия, 1996), 13-м международном совещании "Nucleosides, Nucleotides,
and their Biological Applications" (Монпелье, Франция, 1998), симпозиуме "Dynamic Organization of Nuclear Function" (Нью-Йорк, США, 1998), конференции "26th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies" (Ницца, Франция, 1999).
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 112 страницах, содержит 20 рисунков и 3 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 177 литературных источников.