Введение к работе
Актуальность проблемы, Ключевая роль макроструктуры генома эукариот в процессах генной регуляции клеточного метаболизма получила в настоящее время достаточно глубокое теоретическое и экспериментальное обоснование. Общепринятым стало представление, что геном как интегральная генетическая система может быть осмыслен только при одновременном развитии исследований всех уровней его структурной организации. Подобные исследования для генома хлоропластов, без которых невозможно понимание механизмов репликации и транскрипции в пластидах, находятся в начальной стадии. Каким образом осуществляется в клеточных органеллах компактизация ДНК и каковы механизмы, с помощью которых поддерживается надмолекулярное состояние ДНК хлоропластов in vivo, остается неизвестным. На данный момент существуют лишь данные электронной микроскопии (Briat et al., 1982; Salganik et al., 1991), свидетельствующие о наличии сходства в строении хромосом на молекулярном уровне в ядрах эукариот и геномах пластид. Однако совсем не изучен способ формирования нуклеопротеидного комплекса хлоропластов, в частности, неизвестно, соблюдается ли нуклеосомный принцип упаковки ДНК или же существует другой, принципиально отличный механизм компактизации пластидной ДНК. Очевидно, что упаковка ДНК должна осуществляться посредством взаимодействия с одним или несколькими ДНК—связывающими белками. Существует ряд исследований нуклеоидов хлоропластов, охарактеризован их общий белковый состав, но не решен вопрос, какие именно белки и каким образом непосредственно принимают участие в организации макроструктуры нуклеопротеидного комплекса пластид (Briat et al., 1982; Юрина и др., 1988; Crevel et al., 1989; Neraoto et al., 1989, 1990, 1991; Yurina et al„ 1995).
В этих исследованиях все методы изучения ДНК—связывающих белков хлоропластов основывались на выделении нуклеоидов с предварительным лизисом пластид. При этом в случае использования
ионных детергентов и сильных восстановительных агентов белковые контакты с ДНК могут нарушаться, что приводит к потере некоторых белковых компонентов в процессе выделения нуклеоидов, а в случае использования неионных детергентов может происходить также и артефактное перераспределение белков на ДНК.
По этим причинам представляется особенно интересным. использование методических подходов, связанных с фиксацией белков на ДНК в интактных хлоропластах с образованием прочной ковалентной связи ДНК—белковой сшивки в месте их контакта с последующей идентификацией как пришитых белков, так и последовательностей ДНК, участвующих в формировании нуклеопротеидного комплекса пластид.
Методика ковалентных сшивок позволяет зафиксировать существующие ДНК—белковые контакты как in vitro, так и in vivo, в результате чего образуется стабильный комплекс ДНК с белком. Преимущества этого очевидны: материал в процессе изучения можно подвергать достаточно жестким воздействиям без нарушения стабильности полученной структуры.
Такой методический подход представляется достаточно перспективным, вследствие чего появляются многочисленные новые модификации этого метода, Объединяя его с методом гибридизации с "белковыми тенями" (Karpov et al., 1982), исследователи получают возможность наиболее адекватно исследовать распределение белков на ДНК.
Цель работы. Цель работы состояла в исследовании ДНК— связывающих белков хлоропластов с использованием метода ковалентной ДНК—белковой фиксации в условиях in vivo. При этом были поставлены следующие задачи:
1. Разработка метода ковалентных ДНК —белковых сшивок, индуцированных радикал—продуцирующим комплексом 1,10— фенантролин —Cu(II). Исследование механизма химических реакций, сопровождающих образование сшитого дезоксинуклеопротеидного комплекса,
2. Обнаружение ДНК — связывающих белков хлоропластов с
использованием нового метода ковалентной сшивки и определение их
функциональной роли,
3. Выявление участков хлоропластного генома,
взаимодействующих с обнаруженными ДНК—связывающими белками.
4. Исследование роли ДНК—связывающих белков в упаковке
хлоропластной ДНК.
Научная новизна и практическая ценность работы. В данной
работе для обнаружения ДНК—связывающих белков хлоропластов
впервые был применен метод ДНК—белковых сшивок, индуцированных
радикал—продуцирующим комплексом 1,10—фенантролин — Си (II) в
условиях in situ. Бесспорное преимущество данного метода состоит в
том, что, в отличие от других подходов, он позволяет исследовать
нативную структуру нуклеоидов без разрушения хлоропластов. Этот
метод в комбинации с подходом, известным под названием
гибридизации с "белковыми тенями" (Karpov et al., 1982; Nacheva et al.,
1989), дает возможность сравнивать белковый состав различных
нуклеотидных последовательностей генома. С использованием этих
методов было выявлено существование нескольких ДНК—связывающих
белков, которые входят в состав нуклеопротеидного комплекса
хлоропластов. Они взаимодействуют со всеми исследованными
фрагментами хлоропластной ДНК, содержащими как
фотоиндуцируемые, так и конститутивные гены. Таким образом, было показано, что обнаруженные белки выполняют структурную функцию.
Дальнейшее исследование ковалентно связанных с ДНК белков, радиоактивно меченных по нуклеотидному остатку, позволило определить молекулярные массы семи полипептидов, образующих ДНК —белковый комплекс хлоропластов, которые составили: 12; 14; 17; 20; 27; 31 и 34 кДа, соответственно. Сопоставление электрофоретической подвижности в ПААГ в присутствии ДДС—Na хлоропластных сшитых нуклеотид —пептидов, белков, экстрагирующихся 0.4N серной кислотой, и полипептидов, образующих ДНП — структуры в хлоропластах, выявило, что в целом они совпадают.
Теоретическое значение работы состоит в том, что впервые было
показано наличие субъединичного принципа строения
макромолекулярнои структуры иуклеоидов хлоропластов (на примере гороха), элементарной единицей которой является нуклеосомо — подобная частица. В ее состав входят обнаруженные ДНК — связывающие белки и фрагменты хлоропластной ДНК, кратные 184 п.н.,. что отличается от длины нуклеосомного повтора хроматина ядер (гороха), составляющей 170 пя. Было показано, что белковый состав обнаруженных хлоропластных ДНП—структур очень близок по электрофоретической подвижности в ПААГ в присутствии ДДС —Na с пістонами клеточных ядер. Все эти данные являются первым биохимическим подтверждением гипотезы, предполагающей существование нуклеосомо—подобных структур, принимающих участие в упаковке хлоропластной ДНК (Briat et al, 1982; Kiseleva et. al, 1988, 1989; Salganik et. al,1991).
Практическое значение работы состоит в разработке нового метода фиксации ДНК—белковых взаимодействий с использованием радикал—продуцирующего комплекса 1,10—фенантролин—Cu(II), основными достоинствами которого, являются: мягкие условия сшивки, широкий диапазон температур и рН, небольшая продолжительность реакции, высокая эффективность сшивки белков с ДНК, отсутствие модификации белков и оснований нуклеиновых кислот, возможность проведения сшивок как в условиях in vitro, так и в условиях in vivo. Все это позволяет использовать данный метод при анализе ДНК—белковых комплексов в различных биологических системах. В работе были изучены возможности метода и механизмы химических реакций, сопровождающих образование ковалентной связи между дезоксирибонуклеиновой кислотой и аминокислотами белка, индуцированной комплексом 1,10—фенантролин — Си(П) в присутствии перекиси водорода в анаэробных условиях.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиуме под эгидой ЮНЕСКО "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии" (Москва, .Дубна, 1997), на Международном симпозиуме "Проблемы и тенденции
фотобиохимии" (Москва, 1997), на III—ем Симпозиуме российского общества физиологов растений (Москва, 1997), на II —ом Съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), на Международной конференции под эгидой Центра научных исследований г. Афины "Хлоропласта: молекулярная биология и биотехнология", (Крит, Греция, 1998), на Международном симпозиуме "Молекулярные механизмы стрессовых ответов" (Москва, 1998).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Список публикаций приведен в конце автореферата.
Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, заключения и списка цитированной литературы. Работа изложена нах^'страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 2 таблицы. Список цитированной литературы содержитшработ.