Введение к работе
Актуальность проблемы. В основе молекулярного механизма мышечного сокращения и множества других явлений клеточной подвижности лежит взаимодействие головок миозина с актином, сопровождаемое гидролизом АТР. Молекула мышечного миозина представляет собой гексамер, состоящий из 6 субъединиц: двух тяжелых и четырех легких цепей. Тяжелые цепи на большем протяжении закручены в двойїгуїо суперспираль, образуя стержневую часть молекулы. N-концевая часть каждой тяжелой цепи образует глобуляр1гую головку, с каждой из которых ассоциированы 2 легкие цепи. При ограпиченном протеолизе можно получить изолированные миозиновые головки, называемые субфрагментом -1 миозина (S1)) который сохраняет все главные свойства миозиновой головки: АТРазную активность и способность взаимодействовать с актином, являясь, таким образом, идеальным объектом для изучения структуры и свойств миозиновой головки.
Ключевую роль в молекулярном механизме мышечного сокращения играют конформационные перестройки, происходящие в миозиновой головке в ходе АТРазной реакции: М + АТР <-» М--АТР <-> M"-ADP-Pi о M-ADP + Pj <-> М + ADP
где М* и М" - миозиновая головка в измененной конформации. Промежуточные состояния миозиновой головки в ходе АТРазной реакции, М*-АТР и М**-ADP-Pj, подвергаются в последнее время интенсивному изучению. Время жизни этих интермедиатов в процессе АТРазной реакции определяется секундами что совершенно недостаточно для применения большинства методов структурных исследований. Поэтому для изучения структуры S1 в таких промежуточных комш2ксахисполЕуются стабиГные аналоги этих интермедиатов - тройные комплексы S1 с ADP и аналогами Pj, такими как анионы ортовападата (V,), и фторидов бериллия (BeFx), алюминия (А1р4~) или скандия (ScFJ ОдТшм из методов, применяемых для изучения структуры S1 в таких стабильных тройных комплексах, является метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), позволяющий в деталях изучать процесс теплового разворачивания белка. Изменения в характере этого процесса свидетельствуют о структурных перестройках белковой молекулы. Ранее в нашей группе этотметод был применен для исследования стабильных тройных комплексов S1-ADP-Vi и S1-ADP-BeFx. Было показано, что образование этих комплексов вызывает значительные структурные перестройки в молекуле S1, выражающиеся в значительном увеличении термостабилыюсти S1 и в изменении его доменной структуры [Levitsky et al., 1992; Bobkov et al., 1993].
Цель и задачи исследований. Целью представленной работы было изучение механизма таких перестроек. Для этого используются следующие подходы: проводятся видоизменениявсех трех компонентов тройных комплексов миозиновой головки с ADP и аналогами Р, - белка,
нуклеотида и аналога Pif после чего методом ДСК исследуется влияние этих изменений па характер тепловой денатурации миозиновой головки в этих комплексах. Исследования в этих направлениях и составляли цель настоящей работы. Конкретные задачи сводились к тому, чтобы исследовать методом ДСК тепловую денатурацию миозиновой головки в ее тройных комплексах с ADP и аналогами РІ, используя следующие видоизменения компонентов этих комплексов:
-
Специфическая модификация (тринитрофенилировапис) остатка Lys-83 в молекуле S1 из скелетных мышц кролика.
-
Метилирование всех лизиновых остатков в молекуле S1.
-
Модификация ADP по аденину и по рибозному кольцу, а также использование вместо ADP ее искусственных аналогов -ненуклеозидных органических дифосфатов.
-
Использование в качестве аналогов фосфата фторидов алюминия и скандия, эффекты которых ранее не исследовались методом ДСК.
-
Использование вместо S1 из скелетных мышц гладкомышечного тяжелого меромиозина (НММ), содержащего две головки с дефосфорилированными или с фосфорилированными регуляторными легкими цепями (RLC).
Научная новизна. Впервые методом ДСК были исследованы протеолитические фрагменты гладкомышечного миозина, такие, как S1, S2 и НММ, а также комплексы S1 с ADP и новыми аналогами неорганического фосфата - ALF4~ и ScFx. Получены новые доказательства того, что комплекс S1-ADP-BeFx отличается от всех других тройных комплексов S1 с ADP и аналогами Р< и соответствует миозиновой головке в промежуточном комплексе М*-АТР АТРазной реакции миозина, тогда как комплексы S1-ADP-Vir S1-ADP-A1р4~ и Sl-ADP-ScFx соответствуют, скорее всего, интермедиату М"-ADP-
Pi-
Практическая ценность работы состоит в том, что полученные результаты являются основой для дальнейшего изучения механизма мышечного сокращения. Разработанные методические подходы к исследованию информационных перестроек S1 могут быть использованы в структурных исследованиях других белков.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на XXII Европейской конференции по мышечному сокращению и клеточной Подвижности (Гватт, Швейцария, 1993), па международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 1994), на 39-м Конгрессе Биофизического общества США (Сан-Франциско, Калифорния, США, 1995) и на II -м Съезде Биохимического Общества РАН (Москва, 1997).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из
введения, обзора литературы, описания материалов и методов,
изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой
литературы. Работа изложена на стр., содержит 39 рисунков и 5
таблиц. Список цитируемой литературы включает источников.