Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Гемсодержащие оксидазы (комплекс iv) являются заключающим звеном дыхательной цепи живой клетки и катализируют реакцию восстановления кислорода до воды. Химические процессы, протекающие при восстановлении кислорода, приводят к образованию на мембранах живых организмов градиента протонов и запасанию энергии в виде разности электрохимических потенциалов ионов водорода на мембране. Запасание энергии в виде разности электрохимических потенциалов ионов водорода на мембране (Дцн+) является одним
ИЗ ВаЖНеЙШИХ ПОЛОЖеНИЙ ХеМИОСМОТИЧвСКОЙ Теории МИТЧеЛла (Mitchell
1961, 1966), которая получила множественное экспериментальное подтверждение за последние 20 лет. Кроме того, было показано, что некоторые оксидазы являются истинными протонными переносчиками и переносят ПРОТОНЫ С Внутренней СТОРОНЫ Мембраны Наружу (Puustinen et al., 1991; Wikstrom et al., 1979; 1984). Бактериальные ОКСИДЭЗЫ OT-
личаются большим разнообразием по сравнению с эукариотическими. По специфичности к природному донору электронов бактериальные оксидазы делятся на одтохром-с- и хшолоксидазы. Ферменты обеих групп входят в состав надсемейства протонпереносяпщх оксидаз, содержащих би-ядерный гем-медный центр, в котором происходит восстановление кислорода до воды. Существуют оксидазы, не входящие в надсемейство оксидаз. В качестве примера можно привести оксидазу м-тта классического объекта исследований Escherichia coii. Эта хинолоксидаза не
СОДерЖИТ МеДИ И НЄ переносит ПРОТОНЫ (Puustinen et al., 1991). ВОЗМОЖНО, в качестве сопрягающего иона используется не протон, а натрий. Такое Предположение бЫЛО ВЫДВИНУТО В.П.СкулачеВЫМ (Skulachev, 1989, 1991, 1994) В раМКЭХ ТвОрИИ НЭТрИеВОЙ бИ03НЄрГЄТИКИ, ПрИЗВЭН-
ной объяснить ряд затруднений, возникающих при описании с помощью
хемиосмогической теории Митчелла биоэнергетических процессов у бактерий, живущих при пониженных значениях лДн+.
Объектом наших исследований была гало- и алкалотолерантная бактерия Bacillus sp. ftu (Bacillus haiodurans ftu) , обнаруженная и описанная в лаборатории биоэнергетики (Верховская и др., 1988). На терминальном участке дыхательной цепи этой бактерии были обнаружены протон- и натрийспецифичные составляющие дыхания (Kostyrko et ai., 1991). Было показано, что транспорт протонов суббактериальными частицами ингибировался цианидом в микромолярных концентрациях; тогда как для подавления транспорта ионов натрия требовались на порядок бОЛЬШИе концентрации (Kostyrko et al., 1991). В НЭШеЙ Группе
было показано, что данная бактерия содержит оксидазы двух типов: саа3-типа и (ітредположительно) о-типа, на порядок различающиеся по чувствительности к цианиду (Мунтян и Скрипникова, 1993). Какая из двух обнаруженных оксидаз ответственна за транспорт протонов, а какая - за транспорт ионов натрия, установлено не было. Данный вопрос служил предметом дискуссий.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ. В задачу данной работы входило изучение просте-
ТИЧЄСКИХ ГРУПП И ИОНТрансПОрТНЫХ СВОЙСТВ ОКСИДаз В.haiodurans FTU и
их сравнение с хорошо изученными оксвдазами Ъо- и ьз-типов е. соіі с
ЦелЫО установления ИОННОЙ СПецифИЧНОСТИ ОКСИДаз В.haiodurans FTU.
НОВИЗНА РАБОТЫ. Установлен гемовый состав двух ранее обнаруженных ОКСИДаз В.haiodurans FTU. В СООТВЄТСТВИИ С ГЄМОВНМ СОСТЭВОМ
оксидаза с высокой чувствительностью к цианиду отнесена к саа3-ти-пу, а оксидаза с низкой чувствительностью к ингибитору, ранее описанная как о-типа, - к ьь-типу.
* В 1996 году бактерия Bacillus sp. ftu определена до вада и названа Bacillus haiodurans FTU (ГрИНКеВИЧ И Др., В ПЄЧЗТИ).
Установлено, что оксидаза саа,-типа, в отличие от оксидазы ъь-типа, принадлежит к надсемейству оксидаз с гем-медным биядерным центром.
Показано, что оксидаза саал-типа переносит до двух н+ на один потребленный атом о. Соотношение н+/о для оксидазы >ь-типа близко к нулю, что позволяет отнести оксидазу ьь-типа к непротонным генераторам энергии.
Определены природные (непроникащие) доноры электронов для оксидазы саа3-твда, что позволит провести работу по изучению ионной специфичности оксидазы, встроенной в протеолипосомы. Разработаны методы выделения мембранного и растворимого цитохромов с из бактерии B.halodurans FTO.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Проведенные исследования позволили еыявить новые фундаментальные закономерности в организации оксидаз микроорганизмов и предоставили новые подходы к систематике бактериальных оксидаз, отличающихся большим многообразием. Углубление знаний о терминальных оксидазах бактерий позволяет оптимизировать условия выращивания важных для промышленности микроорганизмов и разрабатывать новые средства борьбы с патогенными бактериями.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты диссертационной работы были представлены на научных семинарах лаборатории биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ (Москва, 1994, 1996), на 7-ой (Хельсинки, 1992) и 9-ой (Лоуван-ла-Нев (Бельгия), 1996) Европейских биоэнергетических конференциях, на Мевдународной встрече "Основные электрон-транспортные комплексы в фотосинтезе и дыхании" (Гмунден (Австрия), 1993), на і и п Всероссийских конференциях "Белковая инженерия" (Москва, 1994, 1995), на Мездународ-ном совещании "Мембранная биоэнергетика" (Москва, 1995).
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 7 работ и одна статья находится в печати.
СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация включает рисунков, таблиц.