Введение к работе
Актуальность проблемы
Данная работа посвящена актуальной проблеме - исследованию взаимосвязи между структурой и функцией представителей двух суперсемейств молекулярных шаперонов -периплазматического шаперона CaflM, клонированного из бактериального возбудителя чумы. Yersinia pestis, и малого белка теплового шока, Hsp25 мыши. Изучаемые белки, несмотря на разную распространенность в природе, имеют ряд сходств как в структуре так и в выполняемых функциях. Функционально они относятся к молекулярным шаперонам, по вторичной структуре все они (З-структурные, конформация - иммуноглобулино-подобная.
Как периплазматические молекулярные шапероны так и малые белки теплового шока начали изучаться сравнительно недавно-около 15 лет назад. Несмотря на большой интерес к этим семействам белков и их интенсивное исследование, еще многое в их структуре и функциях остается не изученным. Например, не совсем понятна регуляция экспрессии периплазматических молекулярных шаперонов, не известны детали механизма связывания комплекса шаперон-субъединица с белками-швейцарами, а у малых белков теплового шока плохо изучены не только функции, но и структура. Особый интерес вызывает механизм и специфичность связывания белков шаперонами. Сравнительное изучение двух выбранных суперсемейств шаперонов является эффективным методом поиска ответа на эти вопросы.
Трудно переоценить значение изучаемых белков. Молекулярные шапероны являются белками, выполняющими жизненно важные функции во всех клеточных организмах. Они помогают формированию правильной конформашш белков, сборке их в надмолекулярные структуры, транслокации полипептидных цепей через многочисленные биологические мембраны. Исследования последних лет продемонстрировали важную роль молекулярных шаперонов в развитии иммунного ответа. Более того, было высказано предположение, что внутриклеточные шапероны являются важнейшими элементами системы естественного внутриклеточного иммунитета, которая распознает изолирует и способствует протеолитическому расщеплению неправильно свернутых или неправильно ассоциированных в результате стрессового воздействия на клетку (например теплового шока или окислительного стресса) или генетических повреждений (например, мутаций или опухолевого перерождения клетки) собственных белков а также чужеродных белков-продуктов
вирусной или внутриклеточной бактериальной инфекции. Периплазматические молекулярные шапероны и малые белки теплового шока могут иметь большое практическое значение в области медицины и биотехнологии, благодаря своим уникальным свойствам.
Цель и задачи исследования
Непосредственной целью данной работы явилось изучение взаимосвязи между структурой и функцией белков Сafl М и Hsp25, наиболее типичных представителей двух различных семейств иммуноглобулино-подобных молекулярных шаперонов.
Основные задачи исследования:
-
Изучение структуры Cafl М с использованием методов спектроскопии. .
-
Исследование функциональной роли двух основных отличительных структурных признаков CaflМ-подобных периплазматических шаперонов: 1) двух консервативных остатков Cys и 2) дополнительной последовательности (FGL).
-
Исследование структурного и функционального значения межмолекулярной дисульфидной связи в Hsp25 мыши.
-
Изучение возможности применения системы белков caf оперона для повышения уровня секреции рекомбннантных белков.
Научная новизна
Новизна и приоритет результатов настоящей работы подтверждены четырьмя публикациями в международных журналах (с общим рейтингом цитируемости около 12) и одной заявкой на патент (Финляндия).
Впервые с использованием методов спектроскопии была подробно изучена структура периплазматического шаперона CaflМ. Доказано существование внутримолекулярной дисульфидной связи в этом белке. Исследовано значение этой дисульфидной связи и дополнительной последовательности FGL для структуры и функции СaflМ. Было обнаружено, что как дисульфидная связь так и дополнительная последовательность критичны для функционирования CaflМ. Мутант CaflМ Cys-»Ala, не способный образовывать дисульфидную связь, потерял способность правильно сворачиваться в периплазме и быстро деградировал. Подобный эффект наблюдался при экспрессии нативного белка в штамме Е coli делегированном по периплазматической
дисульфид изомеразе DsbA. В то же время, при восстановлении дисульфидной связи в нативном белке СaflМ, общая структура CaflM сохранялась. Наблюдались только локальные изменения в связывающем центре. При этом происходило снижение сродства СаПМ к Cafl. Из полученных данных следует вывод о важной роли остатков Cys в корректном сворачивании белка in vivo при содействии периплазматической дисульфид изомеразы. Делегированный по последовательности FGL мутант dCaflM, напротив, сворачивался в правильную конформацню. Однако, он был функционально не активен и не связывал Cafl в эксперименте in vitro. Был сделан вывод об участии последовательности FGL в связывании Cafl.
Впервые обнаружено, что Hsp25 образует межмолекулярную дисульфидную связь in vivo в условиях окислительного стресса. С помощью ряда методов (спектроскопии, ультрацентрифугирования, гель-фильтрации, экспериментов по исследованию шаперонной активности) изучены изменения конформации и активности Hsp25, вызываемые образованием дисульфидной связи. Окисление Hsp25 было промоделировано in vitro в окислительно-восстановительных буферах глутатиона. Была определена кинетика тиол-дисульфидного обмена Hsp25 с глутатионом и предложен механизм этого процесса. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии значительных изменений в конформации белка при его окислении. Более того, не были обнаружены изменения в шаперонной активности Hsp25. Тем не менее, окисление происходило с высокой скоростью и в относительно мягких окислительных условиях. Эти данные, свидетельствуют о близком расположении реагирующих остатков Cys в олигомерной структуре Hsp25, что согласуется с обнаруженным ранее с помощью дифференциальной адиабатической сканирующей микрокалориметрии (ДАСМ) существованием стабильных димеров в олигомерной структуре белка. Более того, полученные данные позволяют локализовать контактные поверхности между субъединицами в димере. Основываясь на этих экспериментальных данных совместно с полученными недавно результатами дтэугих исследователей можно сделать вывод о различном способе олигомеризации малых белков теплового шока млекопитающих и бактерий.
Практическая ценность результатов работы
Оперон caf впервые был использован для солюбилизации секретируемых в периплазму рекомбинантных белков. Секреция рекомбинантных белков в периплазму дает большие преимущества. Например, существенно облегчается дальнейшая очистка белков,
достигается правильное сворачивание секретируемых белков с образованием нативных изомеров дисульфидных связей и нативных изомеров пролиновых остатков. Достижение правильного сворачивания белков критично для их применения в медицине. Так, например, у 80 % пациентов при лечении рекомбинангным человеческим интерфероном а, получаемым из бактериальных телец включения, образуются аутоантитела к этому белку. Поэтому парентеральное введение рекомбинантных белков, полученных нз цитоплазмы бактерий, может быть опасно для здоровья больных.
Однако, не все белки могут быть секретированы в растворимом виде в периплазму. Ярким примером является hIL-ф, который застревает во внутренней мембране. Для солюбилизации этого белка был создан фьюз hIL-ip с Cafl, который при ко-экспрессии с СаПМ накапливался в растворимом виде в периплазме и детектировался моноклональными антителами к hIL-ip. Кроме того, сходным образом удалось достигнуть солюбилизации двух других, коммерчески ценных белков, hlL-lra и GM-CSF (Петровская Л., ИБХ, Москва), что позволяет сделать вывод о универсальности предложенного подхода. На основе этих результатов была подана заявка на патент в Финляндии.
Апробация работы
Материалы диссертации были представленны на:
Конференции, посвященной памяти академика А.А. Баева (Москва, 1996);
Российско-американской конференции «NASA/RSA Science and Technical Advisory
Council Research» (Королев, 1996);
13-oM Европейском иммунологическом конгрессе (Амстердам, Нидерланды, 1997);
8-ой ежегодной конференции BioCity (Турку, Финляндия, 1997);
3-ем Международном Конгрессе патофизиологов (Лахти, Финляндия, 1998).
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 8 глав, выводов, списка сокращений и списка литературы. Она изложена на 140 страницах, содержит 47 рисунков и фотографий, 4 таблицы и 263 библиографических источника.
б