Введение к работе
Актуальность проблемы. Аденилатциклаза '(АТР-пирофосфат-лиаза циклизувдая Е.С. 4.6.T.I) представляет собой сложный комплекс, состоящий из одного или нескольких рецепторов, регуляторних GTP-связывакщих белков (G-белков) и собственно каталитического компонента.. Основная функция адекилатциклазного комплекса заключается в передаче гормонального сигнала внутрь клетки. До недавнего времени полагали, что такая передача осуществляется только за счет изменения активности каталитического компонента аденилатциклазы, и, как следствие, изменения внутриклеточной концентрации сАМР. Сравнительно недавно было показано, что а-субъединица актіширущего белка аденилатцикдазы, о ,-также как и а-субъединицы других с-белков, способна диссоциировать из мембраны в раствор при активации соответствующего с-белка. Это позволяет предполагать, что а-субъединицы G-белков могут являться самостоятельными первичными мессендкерами (Rodbell, 1985).
Известно таккэ, что состояние цитоскелета оказывает влияние на функционирование аденилатциклазной системы. Была показана ассоциация как а-субъединицы, так и р7-К0МПЛ9КСа с цитоскелетом. Однако параметры процесса диссоциации а3-субъединицы из мембраны или цитоскелета в раствор изучены не были.
В литературе описан ряд методик выделения G-белков из мембран различных клеток. Эти методики состоят в экстршсции мембран под действием холата натрия и последующей очистке G-белков различными хроматографическими методами. Однако попытки очистить растворимый G-белок, диссоциирующий из мембран, ' в отсутствие детергента, к настоящему врем«ни не известны. Следовательно, изучение закономерностей диссоциации а-субъединицы из мембран в раствор и
-/-
взаимосвязи этого процесса с активацией св-белка, а также выделение растворимого ов-бежа, представляются своевременными и актуальными.
Цель настоящей работы заключалась в исследовании особенностей процесса диссоциации Gg-белка из мембран эритроцитов человека.
В данной роботе предусматривалось решение следующих задач:
Получение препарата частично очищенного каталитического компонета адниелатциклазы, позволяющего производить функциональное тестирование аБ-белка.
Исследование действия фторид-иона и негидролизуемых аналогов гуаниловых нуклеотидов на солюоилизацшо активности G -белка.
Исследование локализации в' мембране эритроцитов человека активности G -белка."
Выделение 06-белка путем его избирательной солюбилизации.
Научная новизна работы. В ходе настоящей работы были подобраны условия для осуществления реконструкции в фосфолипидных везикулах аденилатциклазы из хвостатых ядер мозга быка и од-белка из мембран эритроцитов человека.
В работе впервые изучены параметры процесса диссоциации а-еубъединицы Gg-белка из мембран в раствор под действием активаторов, 'таких как фторид-ион и гуаниловые нуклеотиды, и показано их совпадение с параметрами активации Gg-белка. Показано также, что около 50 Gg-белка связано с фракцией цитоскелета, разрушающегося при обработке раствором с низкой ионной силой.
Оригинальным является предложенный метод очистки Gg-белка. Первая стадия выделения, ионообменная хроматография, проведена в отсутствие детергента.
Практическое значение работы. Практическая ценность работы
состоит .в том, что предложенный в ней метод выделения Gg-белка позволяет получить высокоочищенный препарат белка за 3 хромэтогрэфическиэ стадии. В результате выделения белок очищен в 120 раз по сравнении с исходным экстрактом. По сравнению с известной методикой- (Hanski, oilman, 1982), включающей в себя экстракщш под действием холата натрия и 6 хроматографичесюк' стадий, предлагаемый метод более прост и удобен.
Полученные в работе данные подтверждают теорию действия гормонов на клетки, предложенную Родбеллом (Rodbell, 1985, Rodbell, 1987). Согласно этой теории, а-субъединкцы G-белков являются первичными мессендкерами її способны передавать гормональный- сигнал внутрь клетки, диссоциируя из мембраны в цитоплазму при активации. Полученные данные расширяют представления о функционировании регуляторного белка аденилатциклазной системы.
Апробация работы.. Результаты работы доложены на коллоквиуме кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на 4 Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" (Петрозаводск, 1988).
Публикации. ПО теме диссертации опубликовано 3 работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения и обсуждения результатов, еыводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит /#/ страниц машинописного текста, 5 таблиц и 13 рисунков. Список литературы включает 49? источников.