Введение к работе
Актуальность темы. Молекулярная биологик относительно недавно галучила в свой арсенал методов - "гель-кульс-электрофорез" (PFG) оригинальную технику.позволяющую разделять молекулы ДНК крупных )азмеров (до 12,5 млн.п.о.). В условиях пульс-электрофореза іазделение огромых ДНК происходит в агарозном' матриксе под іействием напряжения пульсирующего электрического поля с меняющимся направлением. .
Метод пульс-электрофореза за короткий срок получил широкое ірименение в молекулярно-биологических исследованиях гиномов про-[ эукариот. Особенно успешно его используют при изучении >азличных видов дрожжей, в частности, дрожжей ЗоссЬагщсез erevlaiae.
Дрожжи S.cereutstoe являются объектом фундаментальных іаоораторннх исследований, а также широко применяются в агробиологической промышленности. Хотя к настоящему времени они :орошо изучены генетически и биохимически, использование [ульс-электрофореза открыло новые возможности для изучения сдельных хромосом и манипулирования с ними. С помощью этого іетода стало возможным определение локализации генов в ДНК :ромосом, анализ больших (до 400 т.п.о.) клонируемых фрагментов Щ. в составе векторов типа YAC, крупномасштабное физическое :артирование генома, изучение отдельных структур хромосомы, а так іе сравнительная характеристика кариотипов различных видов и юдов дрожжей. Еоследняя возможность особенно перспективна при інализе промышленных штаммов дрожжей.
Мы применили пульс-электрофорез для изучения последствий итеграции рекомбинан'гной плазмвды pYF91 в дрожжевые хромосомы, "анее в лаборатории были изучены генетические последствия итеграции этой плазмиды в хромосомы дрожжей (Булат, 1984). В «зультате этих исследований была создана коллекция штаммов, у вторых плазмидз интегрирована в большинство хромосом.
В нашей работе предполагалось осуществить с помощью PPG юлекулярный анализ последствий интеграции плазмиды pYF9l в геном [рожжей сахаромицетов. Результаты исследования представлялись іажннми также и для разработки подходов к изучению отдельных ldomocom дрожжей.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы была
идентификавдя дрожжевых хромовом, в которые произошла интеграция плазмида (химерных хромосом), и хромосом с делениями методом пульс-электрофореза в сочетании с другими биохимическими методами. В связи с этим конкретные задачи были таковы: . 1. Апробирование пульс-электрофоретического аппарата конструкции Д.Р.Беригашвшш, отличающегося геометрией электродов ог известных аппаратов, описанных в литературе. Разработка оптимальных условий разделения ДНК хромосом дрожжей сахаромицетов с использованием этого аппарата.
2. Идентификация химерных хромосом, в составе которых содержится
интегрированная плазмида pIF91, методом пульс-электрофореза.
3. Изучение перестроек I химерной хромосомы, индуцированных
7-облучением, методом пульс-электрофореза.
Научная новизна и практическая ценность. В настоящей диссертационной работе разработаны условия электрокариотипирования дрожжей на пульс-электрофоретическом аппарате, представляющем собой модификацию известных конструкций. Подобраны условия разделения ДНК дрожжевых хромосом легких, средних и тяжелых весов отдельно для каждой весовой фракции. Определены размеры ДНК легки;, дрожжевых хромосом лабораторного штамма 6-Д3005 Гатчинской коллекции, совпавшие с размерами ДНК хромосом дрожжевого штамма Х2180-1В, на котором проводились первые исследования по идентификации хромосом дрожжей S.cerevlaiae.
Нами предложен способ визуальной идентификации химерных хромосом в ллектрокариотипе дрожжей сахаромицетов на материале коллекции штаммов с интегрированной плазшдой.
С использованием метода пульс-электрофореза нами были обнаружены перестройки типа делеций в I химерной хромосоме , индуцированные -у-облучением.
Результаты работы подтверждают адекватность метода пульс-электрофореза задаче визуального наблюдения за изменениями ДНИ, происходящими на хромосомном уровне.
В практических целях опыт данного исследования может использоваться при работе с промышленными штаммами дрожжей, претерпевающими в ходе многолетней селекции кариотипические изменения, относящиеся либо к числу хромосом, либо к их структуре (делеции, инсерции, транслокации).
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались или представлялись на школе-семинарэ "Молеку эрная генетика"дрожжей, Петергоф, 1989 г; VII Всесоюзном симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1990 г.; семинаре кафедры генетики ЛГУ, 1990 г.; семинарах ЛИЯФ АН СССР в Отделе молекулярной и радиационной биофизики, 1989-1990 гг.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей.
Объем и структура работы. Диссертация лостоит из введения; обзора литературы по теме исследования; главы, шсвященной описанию использованных материалов и методов; трех глав, содержащих экспериментальные результаты; заключения и выводов. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста; содержит 20 рисунков, 2 таблицы. Список используемой литературы включает 134 наименования.