Введение к работе
Актуальность проблемы
В процессе синтеза АТФ энергия разности электрохимических потенциалов ионов водорода (Д/ін+) переводится в форму энергии фосфо-дпэфирных связей. Мембранный фермент, ответственный за взаимопревращение этих двух форм энергии, Н+-АТФ-спнтаза, называемая также Н+-АТФазой пли FoFi-комплексом (КФ 3.6.1.34), играет ключевую роль в энергообмене клетки, осуществляя сопряжение реакции синтеза/гидролиза АТФ с трансмембранным переносом протонов. Н+-АТФаза обнаружена во внутренней мембране митохондрий, в тилакоидной мембране хлоропластов и в цитоплазматической мембране бактерий; ферменты нз столь различных объектов удивительно близки по строению и каталитическим свойствам.
Н+-АТФаза состоит из интегрированной в мембрану части Fo, участвующей в транслокации понов, и каталитической части Fj, называемой Fj-АТФазой из-за ее АТФазной активности (Рис. 1). Многие данные указывают на то, что Н+-АТФаза — фермент, работающий по принципу молекулярной машины: ток понов через мембранную часть Н+-АТФазы предположительно приводит к механическому движению субъединиц Fo, которое в свою очередь приводит во вращение субъ-едишщы 7 п е Ft(Sabbert, 1996; Noji, 1997); последние, вероятно, механически изменяют конформацию Fi, высвобождая синтезированный АТФ.
Механизм протонного транспорта Н+-АТФазой на сегодняшний день остается предметом споров. Разработано несколько моделей работы Н+-АТФазы, предполагающих вращение кольцевого олпгомера из 12ти с-субъедишщ Fq в процессе протонного транспорта как движущую силу вращения 7-субъединицы внутри Fi (Junge et al., 1997; Elston et al., 1998; Dimroth et al., 1998). В основе механизма функционирования Fo в этих моделях лежит идея двух некоаксиальных протонных полуканалов, выдвинутая В.П. Скулачевым для объяснения механизма работы бактериального жгутика (Glagolev et al., 1978). Предположение о захвате протона через один полуканал и выбросе через второй, смещенный относительно первого, объясняет генерацию вращательного момента за счет трансмембранного переноса протонов. Одна из моделей (Junge et al., 1997) схематично представлена на Рис. 1.
Рисунок 1: Слева — схема строения Н+-АТФазы Е. coli. Субъединицы Fi окрашены, субъединпцы Fo белые. Справа — модель функционирования Fq по Юнге.
Но описанные модели не объясняют механизм сопряжения ионного транспорта с синтезом/гидролизом АТФ. Без ответа остается фундаментальный вопрос в понимании механизма работы Н+-АТФазы: как запасается энергия нескольких последовательно транспортируемых протонов для акта синтеза?
В настоящей работе для исследования протонного транспорта была выбрана Н+-АТФаза фотосинтетической бактерии Rhodobacter capsulatus, имеющая минимальный субъединичный состав, близкая эволюционно к Н+-АТФазе митохондрий и функционально к хлоропластному ферменту. Наличие в мембране хроматофоров этой бактерии реакционных центров и Ьс\ -комплекса позволяет генерировать Д0 и запускать Н+-АТФазу вспышкой возбуждающего света; наличие каротиноидных пигментов, поглощение которых линейно зависит от Ді/', позволяет оптическими методами регистрировать протоннй транспорт в микросекундной шкале. Метод импульсной спектрофотометрип оказался чрезвычайно продуктивен для изучения ряда аспектов протонного транспорта через Н+-АТФазу, в частности для выяснения стехиометрии Н+/АТФ.
Цель работы
Целью настоящей работы являлось выяснение механизма сопряжения синтеза АТФ и транспорта протонов Н+-АТФазой. Для этого были поставлены следующие задачи:
Исследовать характеристики протонного транспорта Н+-АТФазой и их зависимость от присутствия субстратов фосфорилирования, ингибиторов Fj, а также характеристики протонного транспорта через Fo в отсутствие Fi.
Исследовать зависимость синтеза АТФ от ДДН+, от концентрации субстратов фосфорилирования и ингибиторов протонного транспорта п Fi.
Количественно связать уровень синтеза АТФ с протонным транспортом через Ы+-АТФазу.
Разработать модель функционирования фермента.
Научная новизна работы
Показано, что в отсутствие субстратов фосфорилирования Н+-АТФаза Rb. capsulatus осуществляет протонный транспорт, не сопряженный с синтезом АТФ. Подобный феномен, известный под названием протонного слипа, до этого был зарегистрирован только на хлоропластном ферменте. Полученные данные позволяют предполагать явление слипа присущим Н+-АТФазам в целом.
Исследовано влияние ингибиторов Fj на протонный транспорт через Н+- АТФазу. Обнаружено, что в условиях синтеза АТФ инибпторы Fi блокируют протонный транспорт лишь до некоторого предела. Этот предел соответствовал уровню протонного транспорта в условиях слипа. Полученные данные указызают на отсутствие жесткого сопряжения между протонным транспортом и катализом.
Обнаружено явление протонного транспорта, не сопряженного с синтезом АТФ в присутствии субстратов фосфорилирования при низких значениях ДДд+. Факт существования порогового значения ДДд+, необходимого для синтеза АТФ, известен давно. В настоящей работе показано, что при подпороговых значениях ДДН+ происходит несопряженный протонный транспорт через Н+-АТФазу.
Предложена модель, объясняющая явление протонного транспорта, не сопряженного с синтезом АТФ в присутствии субстратов фосфорилирования при низких значениях Д/2И+, и явление слипа. В основе модели
лежит принцип запасания энергии, получаемой при транспорте протонов, в виде энергии эластичной деформации фермента. Это предполагает, что для каждого следующего из последовательно транспортируемых протонов пороговое значение Дн+ будет выше, чем для предыдущего. Пороговый Д/Ін+ для транспорта последнего протона, перенос которого ведет к освобождению АТФ из Fj, определяет общий пороговый ДДн+ ДЛЯ синтеза АТФ. При ДДц+ ниже этого общего порога может происходить транспорт первых протонов, не ведущий к синтезу АТФ. Энергия этих протонов запасается в виде эластичного напряжения фермента. В последствии, когда Д/іц+ снизится, эти первые протоны, вероятно, переносятся обратно за счет все той же запасенной энергии.
В случае отсутствия субстратов фосфорилированпя или в присутствии ингибиторов Fi (условия слипа) запасаемая в виде эластичной деформации энергия не может разрядиться через нормальный каталитический акт. Вероятно, в этом случае при высоких значениях Д/2Н+ происходит разрыв связи между Fi и Fo- Затем фермент восстанавливается, но уже в релаксированном состоянии.
Практическое значение работы
Полученные результаты значительно расширяют современные знания о свойствах и механизме функционирования АТФ-синтазы и могут оказаться полезными при изучении других Н+-транслоцирующих АТФаз. В частности, развиваемая в работе гипотеза эластичного сопряжения синтеза АТФ и протонного транспорта может способствовать прояснению многих аспектов работы других макромолекулярных систем. Кроме того, в работе было выдвинуто предположение о роли явления слипа, то есть несопряженного протонного транспорта через Н+-АТФазу, в регуляции мембранного потенциала. Подобный регуляторный механизм может оказаться принципиально важным для объяснения многих явлений на уровне органелл, клетки и организма в целом.
Апробация работы
Диссертационная работа была апробирована на городском семинаре по биоэнергетике в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ (Москва, 1998). Результаты также были представлены на II Международной Конференции по F-АТФ-синтазам и АТФазам V типа (Оснабрюк, Германия, 1998), на X Европейской Биоэнергетической
конференции (Ґетеборг, Швеция, 1998) и на XI Всемирном Конгрессе по фотосинтезу (Будапешт, Венгрия, 1998).
Публикации
По материалам исследований было опубликовано 3 печатные работы.
Структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована тремя таблицами и двадцатью четырьмя рисунками.
Культивирование Rhodobacter capsulatus
В настоящей работе использовался штамм В10 (дикий тип) Rhodobacter capsulatus, любезно предоставленный доктором А. Мулкиджаняном (Университет г. Оснабрюка, Германия).
Клетки выращивались фотогетеротрофно в анаэробных условиях. Среда культивирования содержала: 0.4% малат, 10 мМ КН2РО4, 0.1% [NH„]2S04, 0.2 г/л MgS04-7H20, 0.075 г/л СаС12-2Н20, 0.02 г/л ЭДТА, 0.012 г/л FeS04-7H20 (0.0059 г/л FeS04 безводн.), 1.59 мг/л MnS04, 2.8 мг/л Н3ВОз, 0.04 мг/л Cu(N03)2-8H20, 0.75 мг/л NaMo04-2H20, 0.1 мг/л биотипа, 1 мг/л тиамина, 1 мг/л никотиновой кислоты; рН 6.8.
Получение хроматофороп
Осажденные клетки ресуспендировали в буфере, содержавшем 10% сахарозы, 2 мМ MgCl2, 50 мМ КС1, 30 мМ HEPES, рН 7.4, и вновь осаждали центрифугированием (7000g, 35 мин, 4С). Затем клетки ресуспендировали в буфере того же состава, содержавшем еще 0.5 мМ ДТТ и 100 мкМ АДФ, рН 7.4, и добавляли несколько крупинок ДНКазы. С этого момента все процедуры с суспензией выполнялись при 0С (на льду) и в темноте. Суспензия пропускалась через Френч-пресс (11000-16000 psi), затем крупные клеточные обломки осаждались центрифугированием (30000g 30 мин, 4С). Супернатант центрифугировался (140000g 120 мин, 4С). Осажденные хроматофори ресуспендировалпсь в буфере того же состава,
но без АДФ, и к суспензии добавлялся равный объем глицерина. Полученные хроматофоры хранились при -80.
Измерение АТФазной активности и синтеза АТФ
АТФазная активность хроматофоров измерялась по методу Фиске-Субарроу (Fiske et al, 1925).
Для регистрации синтеза АТФ в ответ на отдельные вспышки использовалась система люциферин-люцифераза. В среде присутствовали 100 мМ глицил глицин, 0.14 мМ люциферин, 3 мкг/мл люциферазы, 10 мМ MgCl2, 0.1% БСА, 2 мМ аскорбат натрия и 5 мкМ дМФ; рН 8.0. Свечение люциферазы регистрировалось 12-ти дпнодным фотоэлектронным умножителем, защшценным от возбуждающего света вспышки фильтрами BG39 и SP600 (Schott). Перед измерением в кювету добавлялись фосфат натрия и АДФ до желаемой концентрации.
Импульсная спектрофотометрия
Схема установки для импульсных спектрофотометрических измерений представлена на Рис. 2.
Источником монпторного света служила галогенная лампа мощностью 100 Вт. Требуемая в эксперименте длина волны мониторного света выставлялась с помощью интерференционного оптического фильтра, находящегося перед кюветным отделением. Как возбуждающий свет использовалась вспышка ксенонової! лампы FX 249 (EG&G Electro-Optics; 4 мкс), с оптическим фильтром Schott. Для регистрации изменений оптической плотности использовался фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) 9817GB (Thorn EMI, Великобритания), защищенный от возбуждающего света фильтрами BG39 и SP600 (Schott). Так как возбуждение пробы монпторным светом было нежелательно, перед кюветным отделением находилась шторка, открывавшаяся за 200-300 мс до вспышки возбуждающего света. Сигнал с умножителя поступал на дифференциальный усилитель и регистрировался осциллографом Nicolett Pro 10 (США), совмещеным с компьютером, осуществлявшим накопление и усреднение сигналов.
Изменения Аф на хроматофорах регистрировались по изменению поглощения каротиноидов (Junge et al, 1968; Jackson et al., 1969; Jackson et al.. 1971).
Изменения поглощения определялись при длине волны мониторного
Усилитель Осциллограф
NicolettPro 10
Рисунок 2: Схема импульсного спектрофотометра.
света 524 нм. Эксперименты проводились в кювете объемом 12 мл, оптический путь составлял 2 см. Во всех опытах в пробе присутствовали 50 мМ КС1, 10 мМ MgCb, 2 мМ KCN для подавления терминальной ок-сидазы, 200 мМ K4Fe[CN]g как редокс-буфер, 5 мкМ дМФ как редокс-медиатор. Редокс-потенциал в пробе составлял около 250-280 мВ. Кроме того, обычно присутствовали 0.3% БСА п 5-Ю мМ глпцил-глицпн илп MOPS, в зависимости от требуемого рН. Хроматофоры добавляли до конечной концентрации бактернохлорофилла 10 мкМ.
Для опытов по регистрации изменений рН использовались хроматофоры, отмытые от буфера с помощью ультрацентрпфугпрования. Остаточная концентрация буфера в отмытых хроматофорах составляла менее 100 мкМ. Изменения рН внутри хроматофоров регистрировались с помощью проникающего красителя нейтрального красного (Mulkidjanian et al, 1994). Регистрация изменений рН снаружи проводилась с помощью красителя бромкрезолового фиолетового (Jackson&Crofts, 1969)