Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее ' время очевидно, что варьирование надмолекулярной организации ферментов- играет исключительно важную роль в регуляции их каталитической активности. Известно, что изменение молекулярного состава и структуры олигомерных ферментов, может солрововдагься . как их активацией или инактивацией, так, и изменением параметров связывания субстратов. В процессе метаболизма многие ферменты образуют- между собой .белок-белковые' комплексы, (ансамбли), что также может'.сопровождаться существенным-изменением, их каталитических параметров.
Изучение всех ' этих процессов. in., vico затруднено, ' с одной
стороны, сложностью организации живой клетки,, а с другой стороны,-
одновременным протеканием в ней множества взаимосвязанных
процессов. Поэтому исследователи, как правило, используют для этой
цели различные модельные системы. Одной из наиболее перспективных
модельных систем является, . на наш взгляд, система обращенных
мицелл поверхностно-активного, вещества (ПАВ)- в органическом
растворителе. При солюбилизации в.. такой системе . ферменты
включаются во внутреннюю полярную полость, мицелл, приобретая
оболочку из гидратированных молекул ПАВ. В 197? году в работах
группы К.Мартинеха было установлено,.что включенные в такие сис
темы ферменты проявляют каталитическую активность. Эти работы
положили начало "мицеллярной энзимблогшг-\- новому научному напра
влению, изучающему функционирование ферментов в, системах обращен-,
них мицелл. ' '"''.
Размер внутренней полости мицелл'можно варьировать в широком диапазоне, изменяя содержание воды в ' системе, поэтому в
.1
гидратированшх ассоциатах ПАВ может помещаться как одна молекула Оелкэ, так и крупные очлковыэ- комплексы как единое целое. їаким ооразом, обращенные мицеллы worn служить матрицами регулиремого размера для разОорки и сборки белковых комплексов различного состава. Иными словами, использование обращенных мицелл, как модельной системы, открывает щ ищипиально новую возможность изучения взаимодействий между разными олигомерными формами ферментов.
Работы по изучении Оелок-Селковых взаимодействий в система
обращенных мицелл до сих пор не выполнялись; более того, само
число олигомерных ферментов, поведение которых детально изучено в
мицеллах, крайне нявелико. . .
В качестве основного объекта экспериментальных исследований был выбран гликолитический , фермент из класса олигомерных nad*-зависимых дегидрогеназ - глицэральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД).Как мы полагали, работа с этой дегидрогеназой, детально изученной во многих отношениях в водном растворе, во-первых, облегчит интерпретация получаемых результатов в системе обращенных мицелл и, во-вторых, позволит прийти к"некоторым общим выводам о роли белок-белковых взаимодействий в функционировании олигомерных ферментов.
Цель работы.Первая цель работы состояла1 в получении различных стабильных и каталитически активных форм ГАФД, а также в характеристике этих форм, как кинетической, так и структурной. Вторая цель работы была связана с получением смешанных комплексов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы (ЛДТ).и изучением взаимного влияния субъедишщ этих, двух дегидрогеназ друг на друга.
" '2.
В рамках этих проблем были поставлены следующие задачи і п. Изучить поведение тетрамврного фермента ГАФД в. системе обращенных мицелл и в случае сохранения его каталитической активности установить кинетические параметры функционирования различных олигоморных форм ГАФД в мицеллах;
2).Охарактеризовать независимыми физико-химическими методами образующиеся олигомерные формы ГАФД;
3).Исследовать белок-белковые взаимодействия на примере взаимо- : действия различных олигомерных форм ГАФД и ДДГ; 4).Выяснить стехиометрию образуюалхся в системе обращенных мицелл биферменткых комплексов.
Научная новизна и практическая значимость работы. На сегодняшний день имеется достаточно много информации' о катализе в обращенных мицеллах ферментами,, молекулы которых являются мономерами. Белки со сложной четвертичной структурой, в том числе и олигомерные NAD^-aaBHCHMue. дегидрогеназы, |.молекулы которых' состоят из нескольких суСъединиц, изучены гораздо менее обстоятельно. Поведение ГАФД в , системе обращенных мицелл до сих пор не исследовалось. В диссертации детально . отработана методология изучения 'олигомерного фермента, в системе обращенных мицелл (на примере функционирования ГАФД в мицеллах).' В обращенных мицеллах-впервые получены и охарактерезованы физико-химическими методами различные олигомерные Форш ГАФД. На основании (собственных) экспериментальных результатов предложены модели организации мономерной,. ддаерноп и тетрамерноп форм ГАФД, которыз согласуются с имеющимися литературными данными, а в ряде случаев' их существенно дополняют.
В работе большое внимание уделено исследованию бифврменткой
системы на примере совместного функционирования ГАФД и ЛДГ в обращенных.мицеллах; Onjjeделено, что между ГАФД и ЛДГ происходит образование комплексов и впервые получено несколько различных по стехиометрии гетероолигомерных белок-белковых комплексов; комплекс между мономером ГАФД и мономером ЛДГ, комплекс меаду димером ГАФД и тетрамером ЛДГ. Как было обнаружено, образование всех этих комплексов сопровождается' уволичокием каталитической активности каждого фермента.
Таким оорэзом, в работе предложена новая методология
конструирования различных гомо- и гетеро- олигомерных форм ГАФД в
.системе обращенных мицелл Аэрозоля ОТ в -октане. Важно отметить,
что во всех случаях, образованные гомо- и гетеро- формы ГАФД
обладали каталитической активностью.
Применяемый в настоящей работе подход к исследованию биферментной. системы в обращенных мицеллах может быть использован для изучения функционирования тройных и более "белковых комплексов, с целью понимания сущности и смысла процессов жизнедеятельности клетки в целом.
Материалы диссертации могут, использоваться в лекционных курсах, читаемых на кафедре биохимии Биологического факультета' и на кафедре химической энзимологии Химического факультета МГУ.
Апробация работы. Результаты работы доложены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на научном семинаре кафедры химической энзимологии Химического факультета МГУ,- на К Объединенном Симпозиуме биохимических обществ на тему "Механизм регуляции клеточной активности" (Ташкент,1989).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,изложения результатов и их обсуждения, выводов и