Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 21
2.1. Ааптаминовые алкалоиды 21
2.1.1. Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из природных источников 21
2.1.2. Биологическая активность ааптаминовых алкалоидов 26
2.1.3. Цитотоксическая активность ааптаминовых алкалоидов по отношению к опухолевым клеткам 2.2. Тритерпеновые гликозиды голотурий 30
2.3. Педерины, оннамиды и микаламиды 33
2.4. «Двухголовые» сфинголипиды морских губок 36
2.5. Гуанидиновые алкалоиды морской губки Monanchora pulchra 38
2.6. JB6 P+ Cl41 клетки как модель для изучения канцер-превентивных веществ 42
2.7. Герминальные опухолевые клетки
2.7.1. Аберрантное развитие и опухоли половых клеток 43
2.7.2. Цисплатин-устойчивые клеточные линии GCT 2.8. Рак простаты 45
2.9. Лимфома Бёркитта
2.10. Рак мочевого пузыря 49
2.11. Апоптоз
2.11.1. Каспаза-зависимый апоптоз 50
2.11.2. Каспаза-независимая клеточная смерть 2.12. Аутофагия 54
2.13. Исследование эффекта комбинации препаратов 57
2.14. Протеомика и методы, применяемые в ней 58
3. Обсуждение результатов 60
3.1. Исследование ааптаминовых алкалоидов морской губки Aaptos sp. 60
3.1.1. Выделение и установление химического строения ааптаминовых алкалоидов из губки Aaptos sp 60
3.1.2. Изучение противоопухолевой in vitro активности и механизмов действия выделенных алкалоидов ааптаминового ряда
3.1.2.1. Цитотоксическая активность 67
3.1.2.2. Канцер-превентивная активность ааптаминовых алкалоидов 68
3.1.2.3. Влияние исследуемых алкалоидов на фосфорилирование МАРК ERKs 70
3.1.2.4. Исследование влияния алкалоидов ааптаминового ряда на AP-1-, NF-кВ- и р53-зависимую транскрипционную активность 71
3.1.2.5. Исследование влияния ааптамина на NT2 опухолевые клетки человека
3.1.2.5.1. Влияние ааптамина на способность к пролиферации и жизнеспособность NT2 опухолевых клеток человека 77
3.1.2.5.2. Исследование про-апоптотической активности ааптамина 78
3.1.2.5.3. Исследование влияния ааптамина на клеточный цикл в NT2 клетках 80
3.1.2.5.4. Выявление белков, регулируемых под действием нецитотоксических концентраций ааптамина в NT2 клетках 81
3.1.2.5.5. Исследование белков, регулируемых под действием ааптамина в NT2 клетках 3.1.2.5.5.1. Анализ экспрессии соответствующих генов 83
3.1.2.5.5.2. Анализ экспрессии белков методами Вестерн-блоттинга и 2D-Вестерн-блоттинга 85
3.1.2.5.5.3. Исследование изменений, происходящих с белком eIF5A
3.1.2.5.5.3.1. Доказательство увеличения экспрессии гипузинированной формы белка eIF5A под действием ааптамина наЖ2 клетки 89
3.1.2.5.5.3.2. Эксперимент по включению 3Н-спермидина 91
3.1.2.5.5.3.3. Исследование влияния ааптамина на уровень содержания ферментов DHS и DOHH в NT2 клетках 92
3.1.2.5.5.3.4. Исследование влияния ааптамина на активность фермента DHS in vitro 93
3.1.2.5.5.3.5. Исследование влияния сверхэкспрессии деоксигипузинсинтазы (DHS) на скорость пролиферации NT2 клеток 95
3.1.2.5.5.3.6. Исследование эффекта ингибитора протеасом MG-132 на процесс гипузинирования белка eIF5A в NT2 клетках 97
3.1.2.5.6. Обсуждение результатов исследования белков, регулируемых под действием ааптамина в NT2 клетках 98
3.1.2.6. Механизмы канцер-превентивного и цитотоксического действия ааптамина 101
3.1.2.7. Исследование действия ааптаминовых алкалоидов на цисплатин-устойчивые опухолевые клетки NT2-R 101
3.1.2.7.1. Сравнение действия ааптаминовых алкалоидов на цисплатин чувствительные NT2 и цисплатин-устойчивые NT2-R опухолевые клетки 101 3.1.2.7.2. Изучение индукции апоптоза ааптамином, деметилоксиааптамином и изоааптамином в NT2-R клетках 103
3.1.2.7.3. Выявление белков, регулируемых в NT2-R клетках под действием ааптамина 105
3.1.2.7.4. Выявление белков, регулируемых в NT2-R клетках под действием деметилоксиааптамина 109
3.1.2.7.5. Белки, регулируемые в NT2-R клетках под действием изоааптамина 112
3.1.2.7.6. Обсуждение результатов экспериментов по действию ааптаминовых алкалоидов на цисплатин-чувствительные (NT2) и цисплатин-устойчивые опухолевые клетки (NT2-R) 115
3.2. Исследование микаламида А из асцидии Polysincraton sp. 119
3.2.1. Выделение и установление структуры микаламида А из морской асцидии Polysincraton sp. 119
3.2.2. Исследование противоопухолевой in vitro активности и механизмов действия микаламида А in vitro
3.2.2.1. Исследование способности микаламида А предотвращать EGF-индуцируемую злокачественную трансформацию клеток JB6 P+ Cl41 и колонеобразование опухолевых клеток HeLa 120
3.2.2.2. Апоптоз-индуцирующая активность микаламида А 121
3.2.2.3. Эффект микаламида А на транскрипционную активность ядерных факторов AP-1, NF-B и p53 в клетках JB6 Cl41 123
3.2.2.4. Исследование влияния микаламида А на MAPK p38, JNK1/2 и ERK1/2 125
3.2.2.5. Обсуждение результатов исследования биологической активности микаламида А 126
3.3. Исследование противоопухолевой in vitro активности гуанидиновых алкалоидов морской губки Monanchora pulchra 127
3.3.1. Исследование цитотоксической активности и механизмов действия монанхоцидина А (Mc-A) на моделях лекарственно-устойчивых герминальных опухолевых клеток 127
3.3.1.1. Исследование цитотоксической активности Mc-A 127
3.3.1.2. Эффект Mc-A на прогрессию клеточного цикла и экспрессию маркеров апоптоза в опухолевых клетках 130
3.3.1.3. Индукция неспецифической белковой деградации под действием Mc-A на опухолевые клетки 133
3.3.1.4. Индукция цитотоксической аутофагии опухолевых клеток NCCIT-R под действием Mc-A 136
3.3.1.5. Индукция пермеабилизации лизосомных мембран (ПЛМ) под действием McA на опухолевые клетки 140
3.3.1.6. Обсуждение результатов исследования in vitro цитотоксической активности Mc-A на опухолевые клетки человека 142
3.3.1.7. Исследование эффекта Mc-A на протеом клеток NCCIT-R
3.3.1.7.1. Выявление белков, регулируемых под действием Mc-A в клетках NCCIT-R 145
3.3.1.7.2. Биоинформатический анализ протеомных данных 150
3.3.1.7.3. Валидация регулируемых белков, открытых методом протеомики 153
3.3.1.7.4. Валидация предсказанного ингибирующего эффекта Mc-A на миграцию и колонеобразование клеток NCCIT-R 156
3.3.1.7.5. Обсуждение результатов анализа эффекта Mc-A на протеом клеток NCCIT- 160
3.3.2. Исследование in vitro канцер-превентивной и цитотоксической активности
гуанидиновых алкалоидов губки Monanchora pulchra на клетках JB6 Cl41 и HeLa 163
3.3.2.1. Исследование in vitro канцер-превентивной активности гуанидиновых алкалоидов губки Monanchora pulchra 163
3.3.2.2. Исследование эффекта алкалоидов 59, 60, 65-68, 71 и 75 на MAPK/AP-1 сигналинг 166
3.3.2.3. Исследование эффекта гуанидиновых алкалоидов на транскрипционную активность белка p53 171
3.3.2.4. Эффект алкалоидов 59, 60, 65-68, 71 и 75 на индукцию программируемой клеточной смерти, а также ареста клеточного цикла опухолевых клеток HeLa 172
3.3.2.5. Обсуждение результатов исследования in vitro канцер-превентивной и цитотоксической активности гуанидиновых алкалоидов губки Monanchora pulchra 175
3.4. Исследование противоопухолевоой активности тритерпенового гликозида
фрондозида А (FrA) из кукумарии Cucumaria okhotensis 179
3.4.1. Исследование активности FrA на моделях рака простаты 179
3.4.1.1. Исследование эффекта FrA на жизнеспособность, способность к пролиферации, а также колонеобразование клеток рака простаты 179
3.4.1.2. Эффект FrA на прогрессию клеточного цикла и индукцию апоптоза клеток рака простаты 182 3.4.1.3. Эффект FrA на экспрессию некоторых про- и анти-апоптотических белков в клетках рака простаты 185
3.4.1.4. Эффект FrA на цитопротекторную аутофагию в клетках рака простаты 187
3.4.1.5. Выявление белков, регулируемых в клетках PC-3 под действием цитотоксических концентраций FrA, с помощью методов протеомики 191
3.4.1.6. Анализ экспрессии открытых с помощью 2D-PAGE белков методами Вестерн-блоттинга и 2D-Вестерн-блоттинга 194
3.4.1.7. Анализ возможных взаимодействий регулируемых под действием FrA белков 195
3.4.1.8. In vivo активность FrA на моделях рака простаты человека 196
3.4.1.8.1. Эффект FrA на рост первичных опухолей и формирование метастазов 196
3.4.1.8.2. Исследование побочных эффектов применения FrA in vivo 199
3.4.1.9. Обсуждение результатов экспериментов по воздействию FrA на опухолевые клетки рака простаты человека 201
3.4.2. Исследование активности FrA на моделях уротелиальной карциномы человека 205
3.4.2.1. Исследование эффекта FrA на жизнеспособность клеток уротелиальной карциномы человека 205
3.4.2.2. Исследование апоптоз-индуцирующего эффекта FrA в клетках уротелиальной карциномы человека 205
3.4.2.3. Исследование роли каспаз и в FrA-индуцируемом апоптозе 206
3.4.2.4. Исследование эффекта FrA на MAPK в клетках RT112 209
3.4.2.5. Исследование эффект FrA на аутофагию в клетках уротелиальной карциномы 210
3.4.2.6. Исследование комбинированного действия FrA с цисплатином или гемцитабином на клетках уротелиальной карциномы человека 213
3.4.2.7. Обсуждение результатов исследования эффекта FrA на клетки уротелиальной карциномы человека 213
3.4.3. Исследование активности FrA на моделях лимфомы Бёркитта 216
3.4.3.1. Исследование эффекта FrA на жизнеспособность клеток лимфомы Бёркитта 216
3.4.3.2. Эффект FrA на прогрессию клеточного цикла клеток лимфомы Бёркитта 216
3.4.3.3. Исследование способности FrA индуцировать каспаза-независимый апоптоз клеток лимфомы Бёркитта 218
3.4.3.4. Исследование эффекта FrA на митохондрии и транслокацию AIF в клеточное ядро 221 3.4.3.5. Исследование роли белка p53 в FrA-индуцируемом апоптозе клеток лимфомы Бёркитта 223
3.4.3.6. Эффект FrA на аутофагию в клетках лимфомы Бёркитта 224
3.4.3.7. Обсуждение результатов исследования активности FrA на моделях лимфомы Бёркитта 225
3.5. Исследование противоопухолевой активности ризохалинина (Rhiz) на моделях
рака простаты человека 228
3.5.1. Исследование эффекта Rhiz in vitro 228
3.5.1.1. Исследование способности Rhiz ингибировать жизнеспособность клеток рака простаты человека 228
3.5.1.2. Исследование апоптоз-индуцирующей активности Rhiz в клетках рака простаты человека 229
3.5.1.3. Исследование эффекта Rhiz на аутофагию в клетках рака простаты 233
3.5.1.4. Исследование эффекта Rhiz на потенциал-зависимые калиевые каналы 237
3.5.1.5. Эффект Rhiz на AR-сигналинг в клетках рака простаты 240
3.5.1.6. Исследование эффекта Rhiz в комбинации с доцетакселем и кабазитакселем, а также с энзалутамидом при действии на AR-V7-положительные клеткам 242
3.5.2. Исследование эффекта Rhiz in vivo 243
3.5.2.1. Подбор дозы Rhiz для испытаний in vivo 243
3.5.2.2. Эффект на Rhiz рост первичных опухолей и индукцию апоптоза опухолевых клеток in vivo 244
3.5.2.3. Исследование побочных эффектов Rhiz in vivo 247
3.5.3. Обсуждение результатов исследования противоопухолевоой активности Rhiz на
моделях рака простаты человека 248
4. Экспериментальная часть 252
4.1. Приборы и материалы 252
4.1.1. Приборы 252
4.1.2. Реагенты 252
4.1.3. Клеточные культуры 255
4.1.4. Выделение и синтез исследуемых веществ
4.1.4.1. Общая информация 257
4.1.4.2. Биологический материал для выделения ааптаминовых алкалоидов и микаламида А 258
4.1.4.3. Поиск и выделение ааптамина и его производных 258
4.1.4.3.1. Скрининг губок 258
4.1.4.3.2. Выделение ааптаминовых алкалоидов 261
4.1.4.3.2.1. Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из губки Aaptos sp.l 261
4.1.4.3.2.2. Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из губки Aaptos sp.2 262
4.1.4.3.3. Восстановление 3-(#-морфолинил)-деметилоксиааптамина (78) 263
4.1.4.4. Выделение микаламида А 263
4.2. Стандартные методики для определения биологической активности веществ 264
4.2.1. Определение цитотоксической активности веществ методом MTS или МТТ 264
4.2.2. Определение способности веществ влиять на пролиферацию клеток (метод с использованием трипанового синего) 265
4.2.3. Определение канцер-превентивной активности веществ 266
4.2.4. Определение способности веществ ингибировать колонеобразование опухолевых клеток в мягком агаре 266
4.2.5. Определение способности веществ ингибировать формирование и рост колоний опухолевых клеток на твёрдой подложке 267
4.2.6. Люциферазный метод определения AP-1-, NFKB- и р53-зависимой транскрипционной активности 267
4.2.7. Приготовление белковых экстрактов для Вестерн-блоттинга, 2D-Вестерн-блоттинга и 2D-PAGE 268
4.2.8. Определение концентрации белка (метод Бредфорда) 269
4.2.9. Вестерн-блоттинг
4.2.10. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле (2D-PAGE) 271
4.2.11. Анализ рисунков 2Б-гелей 272
4.2.12. Идентификация белков методом масс-спектрометрии 272
4.2.13. Двумерный Вестерн-блоттинг (2Б-Вестерн-блоттинг) 273
4.2.14. Анализ экспрессии простатического специфического антигена (PSA) 274
4.2.15. Исследование синергетического, аддитивного или антагонистического эффекта веществ при их комбинировании 274
4.2.16. Исследование антагонистического эффекта SP600125 (ингибитора JNK1/2) 275
4.2.17. Окрашивание одномерных SDS-полиакриламидных гелей красителем кумасси бриллиантовым синим G 250 275
4.2.18. Исследование белков, содержащихся в образцах 1 и 2, методом масс-спектрометрии (см. 3.3.1.3.) 276
4.2.19. Определение активированной каспазы-3 с помощью FACS 276
4.2.20. Окрашивание лизосом красителем акридиновым оранжевым 277
4.2.21. Измерение выхода катепсина В в межклеточное пространство 277 4.2.22. Клеточное фракционирование 278
4.2.23. Метод полимеразно-цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) 2 4.2.23.1. Выделение РНК 279
4.2.23.2. Обратная транскрипция (приготовление кДНК) 280
4.2.23.3. Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) 2 4.2.24. Электрофорез ДНК в агарозном геле 280
4.2.25. Полимеразно-цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ) 281
4.2.26. Метод проточной цитометрии для исследования способности веществ индуцировать апоптоз 282
4.2.27. Метод проточной цитометрии для исследования влияния веществ на клеточный цикл 282
4.2.28. Исследование эффекта вещества на клеточную миграцию 283
4.2.29. Эксперимент по включению 3H-спермидина 283
4.2.30. Исследование влияния вещества на активность фермента DHS in vitro 2 4.2.30.1. Выделение фермента DHS и белка eIF5A 284
4.2.30.2. Измерение уровня активности фермента DHS in vitro
4.2.31. Сверхэкспрессия деоксигипузинсинтазы (DHS) 285
4.2.32. Биоинформатический анализ протеомных данных 286
4.2.33. Подавление экспрессии гена p53 посредством трансфекции с использованием малых интерферирующих РНК (siRNA) 287
4.2.34. Световая микроскопия 288
4.2.35. Иммуноцитохимический метод и флуоресцентная микроскопия 288
4.2.36. Электронная микроскопия 289
4.2.37. Модели подкожных мышиных ксенографтов 289
4.2.38. Оценка роста опухолей и формирования метастазов 290
4.2.39. Квантификация диссеминированных опухолевых клеток, а также циркулирующих опухолевых клеток при помощи Alu-ПЦР 290
4.2.40. Анализ крови животных 291
4.2.41. Статистическая обработка полученных результатов 2 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 293
6. Выводы 296
7. Список литературы
- Герминальные опухолевые клетки
- Изучение противоопухолевой in vitro активности и механизмов действия выделенных алкалоидов ааптаминового ряда
- Эффект микаламида А на транскрипционную активность ядерных факторов AP-1, NF-B и p53 в клетках JB6 Cl41
- Определение способности веществ ингибировать колонеобразование опухолевых клеток в мягком агаре
Введение к работе
Актуальность проблемы. По данным Всемирной организации здравоохранения в 2010 году онкологические заболевания стали основной причиной смертности в мире, обогнав по количеству летальных случаев сердечнососудистые заболевания. Несмотря на многочисленные исследования последних десятилетий по поиску и разработке новых противоопухолевых препаратов следует признать, что на настоящий момент лечение этих заболеваний все еще остается весьма проблематичным. Поэтому поиск новых противоопухолевых соединений и разработка на их основе лекарственных препаратов по-прежнему, остаётся актуальной проблемой современной науки.
С другой стороны, изучение новых природных соединений нередко открывает их неожиданные свойства, которые могут оказаться интересными и перспективными не только для онкологии и других разделов фармакологии, но и для клеточной и молекулярной биологии, а также биохимии. Сами эти соединения могут найти различные применения, в том числе в качестве молекулярных инструментов для различных исследований. Известно, что около 50% известных лекарственных препаратов было создано на основе природных соединений. Следует отметить, что морские метаболиты часто отличаются высокой активностью и нередко являются хорошими молекулярными моделями для дальнейших синтетических модификаций.
Биохимия вторичного обмена морских организмов существенно отличается от процессов, происходящих в наземных организмах. За последние 30 лет из морских гидробионтов были выделены около 30000 новых природных соединений, несколько десятков, из которых в данный момент проходят испытания в качестве потенциальных химиотерапевтических препаратов, и ряд из них (цитарабин, трабектидин (иондолис), эребулин мезилат, и брентуксимаб (эре-булин)) уже введены в клиническую практику. В настоящее время на различных стадиях клинических испытаний находятся противоопухолевые препараты, созданные на основе соединений, выделенных из морских беспозвоночных – халихондринов, бриостатинов, гемиастерлина, дискодермолида, спонгистатина, аплидина, салиноспорамида А и других.
Настоящая работа посвящена изучению особенностей молекулярного действия серии природных соединений из морских губок, асцидий и голотурий, в большей или меньшей степени проявляющих цитотоксические свойства в отношении опухолевых клеток. Данные соединения тестировались в большинстве случаев на различных опухолевых клетках человека in vitro и in vivo.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы было изучение молекулярных механизмов действия ряда морских природных соединений, проявляющих цитотоксические свойства в отношении опухолевых клеток, а также изучение их противоопухолевого действия. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Получить в индивидуальном виде ряд соединений, ответственных за противоопухолевую цитотоксическую активность водно-этанольных экстрактов губки Aaptos sp. и асцидии Polysincraton sp. Установить строение выде-3
ленных соединений. Исследовать противоопухолевую активность выделенных соединений in vitro, а также особенности их молекулярного действия с привлечением современных методов молекулярной и клеточной биологии, включая протеомику.
-
Исследовать противоопухолевую in vitro активность, молекулярные механизмы действия и зависимость «структура-активность» морского алкалоида монанхоцидина А и родственных гуанидин-содержащих алкалоидов, выделенных из морской губки Monanchora pulchra, на моделях лекарственно-устойчивых и -чувствительных герминальных опухолей человека, и некоторых других опухолевых и нормальных клетках.
-
Исследовать противоопухолевую активность и молекулярные механизмы действия морского тритерпенового гликозида фрондозида А, выделенного из дальневосточной голотурии Cucumaria okhotensis, на моделях лекарственно-устойчивого и -чувствительного рака простаты человека in vitro и in vivo; а также в опытах in vitro – активность и молекулярные механизмы действия на моделях уротелиальной карциномы человека и лимфомы Бёркитта.
-
Исследовать противоопухолевую in vitro и in vivo активность и молекулярные механизмы действия морского биополярного сфинголипида ри-зохалинина на моделях лекарственно-устойчивого и -чувствительного рака простаты человека.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Морская губка Aaptos sp. содержит 3-(N-морфолинил)-деметилоксиааптамин, 3-(метиламино)-деметилоксиааптамин, 2,3-дигидро-2,3-диоксоааптамин и 6-(N-морфолинил)-4,5-дигидро-5-оксодеметилоксиааптамин, которые являются новыми представителями класса ааптаминовых алкалоидов.
-
Ааптаминовые алкалоиды, из морской губки Aaptos sp. обладают канцерпревентивной, антипролиферативной и цитотоксической противоопухолевой активностью, они способны преодолевать лекарственную устойчивость опухолевых клеток к цисплатину. Под воздействием нецитотоксических концентраций ааптамина на клетки NT2 происходит гипузинирование эукариоти-ческого фактора инициации трансляции 5A-1.
-
Асцидиия Polysincraton sp. содержит микаламид А. Микаламид А проявляет канцерпревентивные свойства и способность подавлять транскрипционную активность ядерных факторов AP-1- и NFB, а также индуцирует p53-независимый апоптоз опухолевых клеток.
-
Алкалоид монанхоцидин А индуцирует цитотоксическую аутофа-гию и пермеабилизацию лизосомных мембран опухолевых клеток, подавляет миграцию, а также способен преодолевать лекарственную устойчивость опухолевых клеток.
-
Птиломикалин А-подобные соединения активируют киназы JNK1/2 и ERK1/2, а также транискрипционную активность ядерного фактора AP-1, индуцируя p53-независимую программируемую клеточную смерть. Пульхранин А способен ингибировать транскрипционную активность фактора AP-1 и активировать киназу JNK1/2, приводя к p53-независимой смерти опухо-
левых клеток. Урупоцидин А способен вызывать активацию киназ JNK1/2 и ERK1/2 и индуцировать p53- и каспаза-независимую клеточную смерть.
-
Фрондозид А активен в моделях лекарственно-устойчивого рака простаты человека in vitro и in vivo. Механизм его действия включает в себя индукцию апоптоза опухолевых клеток вместе с одновременным ингибированием цитопротекторной аутофагии. Фрондозид А способен индуцировать каспаза- и p53-независимый апоптоз клеток уротелиальной карциномы человека in vitro, ингибировать цитопротекторную аутофагию и усиливать цитотоксические эффекты цисплатина и гемцитабина.
-
Фрондозид А вызывает каспаза- и p53-независимый апоптоз клеток лимфомы Бёркитта in vitro, ингибирует аутофагию и усиливает цитотокси-ческий эффект цисплатина. Вещество способно воздействовать на митохондрии опухолевых клеток и вызывать транслокацию апоптогенной формы AIF в ядро.
8. Ризохалинин проявляет активность в моделях лекарственно-
устойчивого рака простаты человека in vitro и in vivo. Механизм его противоопухолевого действия включает в себя индукцию каспаза-зависимого апоптоза и ингибирование цитопротекторной аутофагии. Потенциал-зависимые калиевые каналы являются одной из молекулярных мишеней исследуемого соединения.
Научная новизна и практическая ценность работы. Из губки Aaptos sp. выделено 4 новых алкалоида ааптаминового ряда. Получены ЯМР- и масс-спектры новых соединений, и изучены их некоторые химические свойства. Впервые выявлена канцерпревентивная активность соединений данного ряда, а также охарактеризованы некоторые особенности механизма действия этих алкалоидов in vitro. Показано, что ааптамин способен активировать процесс гипу-зинирования эукариотического фактора инициации трансляции 5A-1 (eIF5A) – ранее такой эффект для низкомолекулярных соединений известен не был. Из экстракта асцидии Polysincraton sp. был выделен известный микаламид А, исследованы его канцерпревентивные свойства и некоторые детали механизма действия. Впервые охарактеризован необычный неапоптотический механизм цитотоксического действия алкалоида монанхоцидина А, его способность преодолевать лекарственную устойчивость опухолевых клеток, а также способность ингибировать миграцию клеток. Впервые изучены молекулярные механизмы цитотоксического действия морских гуанидиновых алкалоидов монан-хоцидина B, монанхомикалина C, птиломикалина A, пульхранина A, урупоци-дина А, монанхомикалина B и нормонанхоцидина D. Впервые установлено, что морской тритепеновый гликозид фрондозид А ингибирует цитопротекторную аутофагию опухолевых клеток, индуцирует их p53-независимый апоптоз, оказывает эффект на митохондрии и вызывает транслокацию AIF в ядро, а также подавляет рост опухолей в моделях рака простаты человека in vivo. Впервые исследована in vivo активность ризохалинина (агликона ризохалина) и показана его эффективность на моделях рака простаты человека, а также исследован механизм его цитотоксического действия и способность ингибировать сигналинг андрогенового рецептора. Полученные результаты создают основу для даль-5
нейших исследований описанных веществ, как в качестве потенциальных терапевтических противоопухолевых препаратов, так и молекулярных инструментов для различных исследований.
Личный вклад автора. Автором было самостоятельно спланировано и проведено подавляющее число описанных в настоящей работе экспериментов, получены и проанализированы их результаты, кроме ЯМР и масс-спектров исследованных соединений, которые были получены д.х.н. Калиновским В.И. и к.х.н. Дмитренком П.С.; идентификации белков в протеомных экспериментах, которая была проведена доктором Симоной Фенц; экспериментов с применением электронной микроскопии, которые были выполнены профессором Керстин Аманн. Выделение и установление структрур ааптаминовых алкалоидов и ми-каламида А было проведено совместно с д.х.н. Макарьевой Т.Н., к.х.н. Шубиной Л.К., д.х.н. Фёдоровым С.Н. и акад., д.х.н. Стоником В.А. Полученные результаты были самостоятельно оформлены автором в виде статей.
Апробация работы. Результаты работы представлены на международных конференциях Wilsede Meeting “Modern Trends in Human Leukemia and Cancer” в 2012 и 2016 гг (Вильседе, Германия); на международном симпозиуме “Efficacy of biomarkers and personalized cancer therapeutics” в 2012 г (Париж, Франция); на международном симпозиуме FEBS Congress “Mechanisms in Biology” в 2013 г (Санкт-Петербург, Россия); на конгрессе немецкого общества ге-мато-онкологов в 2014 г (Гамбург, Германия); на международных симпозиумах «Targeted Anticancer Therapies» в 2013 г, 2012 г (Амстердам, Нидерланды) и в 2011 г (Париж, Франция); на Второй международной российско-корейской конференции «Current issues of natural products chemistry and biotechnology» в 2010 г, Новосибирск, Россия; на Международном симпозиуме по морским биоресурсам Вьетнама, 2010 г, Ханой, Вьетнам; а также на других конференциях.
Публикации. Всего опубликовано 60 работ, из которых по теме диссертации – 27, включая 17 научных статей, опубликованных в изданиях из списка ВАК, 9 материалов конференций и 1 патент.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 422 цитируемых работы. Работа изложена на 332 страницах, содержит 136 рисунков и 19 таблиц.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему наставнику д.х.н. Фёдорову С.Н., а также своему научному консультанту академику Стонику В.А. Автор благодарит к.х.н. Шубину Л.К. за неоценимый вклад в химическую часть настоящего исследования, а также работу по выделению ааптаминовых алкалоидов; д.х.н. Макарьеву Т.Н. – за предоставленные для исследования вещества, ценные консультации, советы и идеи; м.н.с. Кузьмич А.С. – за помощь в проведении ряда биологичесих экспериментов; д.х.н. Калиновского А.И. и к.х.н. Дмитренка П.С. – за получение и помощь в обработке спектральных данных; н.с. Красохина В.Б. – за определение видовой принадлежности изученных морских организмов; д.х.н. Ермакову С.П. и к.б.н.
Аминина Д.Л. – за ряд советов по организации биологической части исследования; чл.-корр. РАН Васьковского В.Е. – за помощь в работе с научной литературой и сборе информации; к.б.н. Менчинскую Е.C. – за вклад в экспериментальную работу по изучению фрондозида А; к.х.н. Гузий А.Г., к.х.н. Табакма-хер К.С., д.б.н. Калинина В.И., д.х.н. Авилова С.А., к.х.н. Сильченко А.С. – за выделение и очистку некоторых исследуемых веществ, а также научные консультации; всех коллег из Лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН, и других лабораторий. Автор выражает глубокую признательность своим немецким коллегам из Университетской клиники Эппендорф (Гамбург, Германия), и в особенности, доктору Гунхилд фон Амсбург, Джесике Хаушильд, доктору Фридману Хонекеру, доктору Штефану Балабанову и профессору Карстену Букамаеру.
Используемые сокращения. Общие термины: 2D-Вестерн-блоттинг – двумерный Вестерн-блоттинг; 2D-PAGE – двумерный электрофорез в полиак-риламидном геле, используемый при анализе протеома клеток; AIF – апоптоз-индуцирующий фактор; AR – андрогеновый рецептор; AR-V7 – андрогеновый рецептор, вариант сплайсинга 7; BafA1 – бафиломицин A1; CQ – хлорокин; CI – (combinational index) индекс комбинирования; DHS – деоксигипузин синтаза; Diaz – диазоксид; DOHH – деоксигипузин гидроксилаза; eIF5A – эукариотиче-ский фактор инициации трансляции 5A-1; EGF – эпидермальный фактор роста; IC50 – (inhibition concentration 50), концентрация исследуемого вещества, при которой происходит уменьшение количества жизнеспособных клеток на 50%; INCC50 – (inhibition of the number of the colonies C50) концентрация вещества, при которой происходит ингибирование колонеобразования клеток в мягком агаре на 50%; Minox – миноксидил; PBS – фосфатно-солевой буфер; pI – изо-электрическая точка; PI – пропидиум йодид; PSA – простатический специфический антиген; ИФА – иммуноферментный анализ; Противоопухолевая активность – в данной работе – активность вещества по отношению к опухолевым клеткам (in vitro и/или in vivo), так или иначе приводящая к их гибели или замедлению пролиферации; Цисплатин – цис-диаминдихлорплатина (II). Исследуемые вещества: Apt – ааптамин; DOA – деметилоксиааптамин; i-apt – изоааптамин; iP-apt – 3-(изопентиламино)-деметилоксиааптамин; Ph-apt – 3-(фенетиламино)-деметилоксиааптамин; M-DOA – 3-(N-морфолинил)-деметил-оксиааптамин; ma-DOA – 3-(метиламино)-деметилоксиааптамин; MycA – мика-дамид А; FrA – фрондозид А; Mc-A – монанхоцидин А; Mc-B – монанхоцидин B; Mm-C – монанхомикалин C; Pt-A – птиломикалин A; Pch-A – пульхранин A; Ur-A – урупоцидин A; Mm-B – монанхомикалин B; nMc-D – нормонанхоцидин D; Rhiz – ризохалинин (агликон ризохалина).
Герминальные опухолевые клетки
В 1988 году впервые были подробно исследованы цитотоксические свойства ааптамина и его производных [4]. 9-Деметилааптамин (3) и изоааптамин (5) показали намного более сильный цитотоксический эффект на клетки карциномы Эрлиха по сравнению с ааптамином. Авторы объяснили такие различия в активности алкалоидов способностью 9-деметилааптамина (3) и изоааптамина (5), взятых в концентрациях 16 и 8 мкг/мл, соответственно, индуцировать выход ионов калия из клеток [4].
В 2003 году были исследованы цитотоксические свойства ааптаминовых алкалоидов по отношению к KB опухолевым клеткам. Было показано, что при замыкании четвёртого цикла в соединениях этого ряда цитотоксичность резко снижается [9]. Шен и соавторы показали, что этерификация 9-OH-группы изоааптамина (5), так же как и его ацилирование по 4-N-положению приводит к снижению цитотоксической активности, но при этом не наблюдается чёткой корреляции между длиной радикала жирной кислоты и уровнем цитотоксической активности [43]. Так, ааптамин (1), деметилоксиааптамин (2) и изоааптамин (5) продемонстрировали значительную цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам KB16, A549, HT-29 и P388, в то время как ацильные производные были менее активны. Авторы объясняют этот факт меньшей полярностью и растворимостью ацильных производных, и, как следствие, пониженной биодоступностью этих соединений. Также было показано, что гидрирование кольца B и изомеризация скелета приводит к резкому понижению цитотоксичностеской активности [43].
Лонгли и соавторы показали, что 9-деметилаапатмин (3) проявляет селективную цитотоксичность по отношению к клеткам P388 и A549, в то время как цитотоксические свойства деметилоксиааптамина (2) не были селективными [44].
Петит и соавторы показали, что изоааптамин (5) проявляет существенную цитотоксическую активность по отношению к мышиным клеткам P388 (лимфолейкоз), ED50=0.28 мкг/мл, а также по отношению к 6 линиям опухолевых клеток человека [45]. При исследовании полусинтетических производных ааптаминовых алкалоидов было показано, что 9-О-деметилирование приводит к увеличению цитотоксических свойств, в то время как метилирование по положению N-4 приводит к исчезновению цитотоксических свойств. В то же время, 4-N-монобензильные производные ааптамина показывали повышенную цитотоксическую активность [45]. Примечательно также, что 1-N,4-N-бисметилааптамин был более активен по отношению к клеткам P388, чем 4-N-монометилааптамин [32]. Сравнение цитотоксической активности ааптамина (1), деметилоксиааптамина (2) и изоааптамина (5) по отношению к опухолевым клеткам лимфолейкоза P388, рака яичника OVCAR-3, рака центральной нервной системы SF-295, рака почки A498, рака лёгкого NCI-H460, рака кишечника KM20L2 и меланомы SK-MEL-5 показало, что в большинстве случаев деметилоксиааптамин (2) и изоааптамин (5) более цитотоксичны, чем ааптамин (1) [25, 45].
Гул и соавторы исследовали цитотоксическую активность бензоатных производных изоааптамина (5) по отношению к 14 линиям опухолевых клеток. В результате было установлено, что наиболее активными были производные по 9-OH группе, содержащие пара-замещённый бензильный радикал [35].
Гистатин 1 (38), эфир изоааптамина и фосфорной кислоты, был впервые синтезирован группой Петита с целью предотвращения деградации изоааптамина. В условиях живой клетки или организма гистатин 1 (38) претерпевает изменения, результатом которых является гидролиз с образованием изоааптамина (5). Гистатин 1 имеет сходное с изоааптамином значение цитотоксичности по отношению к клеткам P388 [7, 25].
Тестирование производных ааптамина как потенциальных ингибиторов сборки тубулина показали, что только изоааптамин (5) и 9-деметилааптамин (3) обладают слабой ингибирующей активностью, никак не коррелирующей с цитотоксической активностью этих соединений. Другие исследованные производные ааптамина не проявляют этого типа биологической активности [45].
Гистатин 2 (39) был получен группой Петита в 2004 году [32]. Соединение представляет собой 1-N,4-N-бисбензил производное ааптамина. Исследование биологической активности гистатина 2 (39) выявило накопление обработанных им THP-1 клеток в G1-фазе клеточного цикла. Метод кДНК микроэррей выявил даун-регуляцию нескольких генов, кодирующих белки, которые вовлечены в синтез ДНК, что позволило предположить блокирование гистатином 2 S-фазы клеточного цикла [32]. Первые исследования, проведённые Арифом и соавторами, выявили увеличение экспрессии белка p53 под действием ааптамина (1), что могло свидетельствовать о p53 зависимом характере биологического действия ааптамина [46]. Позднее Акои и соавторы установили, что ааптамин способен увеличивать экспрессию p21, белка-супрессора клеточного цикла [47]. Известно, что в нормальных условиях активация экспрессии p21 зависит от p53, мутация которого была обнаружена почти в половине всех типов опухолевых клеток [48, 49]. Было установлено, что ааптамин вызывает увеличение экспрессии белка p21 по p53-независимому механизму, что приводит к остановке клеточного цикла в G2/M фазе [47]. Данное свойство может быть использовано для лечения p53-дефицитных типов опухолей, устойчивых к большинству химиотерапевтических препаратов. Недавно p53-независимый характер активации белка p21 ааптамином был подтверждён Джимом и соавторами на другом типе p53-негативных опухолевых клеток [50]. Кроме всего прочего, было высказано предположение, что одной из причин цитотоксического эффекта ааптамина является его способность интеркалировать в ДНК [36]. In vivo активность ааптамина была исследована группой китайских исследователей в 2015 году на модели гепатоцеллюлярной карциномы [51]. Было показано, что ааптамин может тормозить прогрессию опухоли in vivo, что было объяснено его способностью индуцировать арест клеточного цикла за счёт усиления связывания белка p21 с комплексом Cdk2-циклин D/E, что приводит к ингибированию активности Cdk2 в клетках гепатоцеллюлярной карциномы [51].
Весьма неожиданно, немецкая группа исследователей показала цитопротекторные свойства ааптамина в его нецитотоксических концентрациях на нескольких моделях, включая нормальные клетки почки крысы, а также опухолевые клетки – острый миелоидный лейкоз [52, 53]. Таким образом, в возможных дальнейших клинических испытаниях в качесте противоопухолевого препарата, ааптамин и его производные должен применяться с осторожностью.
Стоит отметить, что опубликованные в 1999 [43] и 2004 [25, 45] годах данные, не согласуются с более ранними исследованиями 1993 года [44], в результате которых была установлена цитотоксическая активность деметилоксиааптамина (2) для клеток лейкемии P388, равная IC50=7.55 мкМ [44]. Так, полученное в работе 1993 года значение цитотоксической концентрации для деметилоксиааптамина (2) по отношению к клеткам P388 [44] в 5 раз больше приведённого в статьях 2004 года [25, 45], и в 160 раз больше приведённого в статье 1999 года [43]. Данные по цитотоксической активности деметилоксиааптамина (2) по отношению к клеткам A549 IC50=24.5 мкМ, приведенные в статье 1993 года [44], также в 17 раз превышают соответствующие данные, опубликованные в 1999 году [43]. Кроме этого, приведённые в статьях 2004 года значения цитотоксичности для ааптамина (1), деметилоксиааптамина (2) и изоааптамина (5) по отношению к клеткам P388[25, 45]превышают опубликованные ранее в 1999 году [43], в 6, 31 и 7 раз, соответственно. Возможно, подобные несогласования связаны с различными методиками проведения биоиспытаний веществ: разными временами инкубации клеток с исследуемыми веществами, различной концентрацией питательных веществ в клеточных средах во время проведения эксперимента и др. К сожалению, в упомянутых выше статьях не приводится детальное описание экспериментов по определению цитотоксических свойств соединений. Таким образом, в ряде работ было показано, что ааптамин и его производные высокотоксичны в отношении тех или иных опухолевых клеток. Имеющиеся противоречия в полученных результатах, возможно, связаны с различными условиями экспериментов и неодинаковой биодоступностью и активностью солевых и основных форм этих алкалоидов.
Изучение противоопухолевой in vitro активности и механизмов действия выделенных алкалоидов ааптаминового ряда
Апоптоз (программируемая клеточная смерть I типа) – это регулируемый и программируемый процесс клеточной гибели, в результате которого клетка распадается на отдельные апоптотические тельца. В процессе апоптоза клетка сохраняет целостность вплоть до поздних стадий процесса, а образующиеся апоптотические тельца также обладают цитоплазматической мембраной и затем поглощаются посредствам фагоцитоза [184, 185]. Таким образом, в отличие от некротической гибели, в организме не происходит воспалительной реакции на продукты распада. Признаками апоптоза являются утрата межклеточных контактов, разрушение цитоскелета, конденсация хроматина, фрагментация ДНК, экстернализация фосфатидилсерина на внешнюю сторону мембраны, сжатие клеток и блеббинг клеточной мембраны [186].
Важнейшую роль в реализации классического апоптоза играют сериновые протеазы – каспазы. В нормальном состоянии эти белки существуют в клетке в виде своих неактивных форм - прокаспаз, активация последних происходит при апоптозе и, как правило, приводит к клеточной гибели. Различают так называемые инициирующие (каспазы 8 и 9) и эффекторные каспазы (каспазы 3, 6, 7) [187, 188]. Активация инициирующих каспаз приводит к последующей активации эффекторных каспаз, что в свою очередь приводит к последующим апоптотическим событиям [188].
Выделяют два основных пути активации апоптоза – рецепторо-зависимый и митохондриальный сигнальные пути. Рецепторо-зависимый путь начинается с активации одного из так называемых рецепторов смерти, таких как TNF или Fas [189]. Активация данных рецепторов приводит к связыванию их с адапторами FADD и TRADD, которые, в свою очередь, связываются с прокаспазой-8 и приводят к её активации. Активная каспаза-8 является протеазой, которая за счёт своей ферментативной протеолитической активности приводит к активации прокаспазы-3 и других эффекторных каспаз (рис.2) [189].
При реализации митохондриального сигнального пути происходит пермеабилизация внешней митохондриальной мембраны, что приводит в выходу в цитоплазму цитохрома С, а также других белков [190]. Цитохром С образует комплекс с Afap-1 (apoptotic protease-activating factor-1) и прокаспазой-9 – так называемую апоптосому – в которой происходит активация каспазы-9 [191]. Далее, активная форма каспазы-9 активирует прокаспазу-3 и другие эффекторные каспазы [188], которые, в свою очередь, приводят к прямому и опосредованному разрушению клеточных структур, таких как ядерные структуры и цитоскелет [188]. Другой проапоптотический эффект каспаз заключается к инактивации белков, блокирующих апоптоз. Так эффекторные каспазы привозят к расщеплению фактора фрагментации ДНК, ДНКазы CAD, анти-апоптотических белков семейства Bcl-2, а также некоторых факторов, участвующих в репарации ДНК, таких как PARP. Всё это приводит к итоге к апоптотической клеточной гибели (рис.2) [188, 192-194]. Рисунок 2. Механизмы каспаза-зависимого и каспаза-независимого апоптоза. Рисунок был адаптирован из опубликованной ранее работы Крёмера и Мартина [195]
Помимо клеточной гибели, осуществляемой посредствам аутофагии и некрозо подобных процессов, тремя важнейшими механизмами, которые могут привести к каспаза-независимой клеточной смерти являются стресс эндоплазматического ретикулума, митохондрий или лизосом, ведущий к пермеабилизации («продырявливанию») последних [196]. Данные процессы могут быть также тесно взаимосвязаны между собой. Наиболее часто встречающийся из них – это пермеаблизация мембран митохондрий (ПММ). Проницаемость митохондриальной мембраны для цитохрома С и других белков регулируется белками семейства Bcl-2, такими как ингибиторы апоптоза Bcl-2 и Bcl-xL, и промоторы апоптоза Bax, Bik и Bid. Соотношение уровней экспрессии данных белков определяет то, приведёт ли проапоптотический сигнал к клеточной смерти и апоптозу и как таковому [192, 195] (рис.2). Другой механизм – это прямое воздействие на митохондрии с образованием в их мембранах пор, что ведёт к увеличению их проницаемости и позже к разрыву мембраны, в результате чего митохондриальные белки выходят во внутриклеточное пространство [46]. Помимо упомянутого выше цитохрома С, который вызывает апоптоз через активацию каспазы-9 посредствам формирования апоптосомы, внимания заслуживают белок Omi/HtrA2, эндонуклеаза G, и AIF (apoptosis inducing factor) (рис.2).
Omi/HtrA2 вместе с другим митохондриальным белком Smac/DIABLO являются ингибиторами белка IAP, который, в свою очередь, является ингибитором активности цитохрома C. Таким образом, Omi/HtrA2 играет роль в каспаза-зависимом, индуцируемом цитохромом C апоптозе. В каспаза-независимом же апоптозе играет роль активность Omi/HtrA2 как сериновой протеазы – аналогичная активности каспаз, которая, однако, не может быть заингибирована z-VAD-fmk [197].
Эндонуклеаза G – это преобладающая эндонуклеаза митохондриального межмембранного пространства, которая вовлечена в регуляцию митохондриального биогенеза, синтез и репарацию ДНК. В процессе пермеабилизации митохондриальных мембран, эндонуклеаза G попадает во внутриклеточное пространство, и далее может транслоцироваться в ядро, где она вызывает деградацию ДНК [198].
Апоптоз-индуцирующий фактор (AIF) является наиболее хорошо изученным медиатором каспаза-независимой клеточной смерти [197]. После выхода из митохондрии в цитоплазму, AIF претерпевает переход из прекурсорной формы (67 кДа) в апоптогенную (57 кДа) [199], и далее транслоцируется в клеточное ядро, где он может вызывать конденсацию хроматина и последующую клеточную смерть. Присутствие активных форм каспаз не являются необходимыми для осуществления данного процесса, хотя и может его ускорить [200].
Таргетирование лизосом лизосомотропными агентами ведёт к пермеабилизации их мембран (пермеабилизация лизосомных мембран, ПЛМ) и выходу во внутриклеточное пространство цистеиновых протеаз катепсинов. Высвободившиеся катепсины инициируют клеточную смерть за счёт своей протеолитической активности, вызывая деградацию белков как в цитоплазме, так и в клеточном ядре [201, 202]. Катепсины вызывают помимо всего прочего также и активацию каспаз, которая, однако, в сценарии ПЛМ не является необходимой для реализации цитотоксического эффекта [195, 196, 203]. Также было показано, что ПЛМ может вести к каспаза-независимой клеточной смерти опосредованно, за счёт таргетирования катепсинами митохондрий, и приводя тем самым уже к их пермеабилизации [204-206], например, за счёт деградации катепсинами анти-апоптотического белка Bid [207].
Значительные повреждения эндоплазматического ретикулума также могут приводить к инициации программируемой клеточной смерти в ответ на нарушение сворачивания белков (unfolded protein response, UPR) или выхода кальция в цитоплазму [208]. Данные событие ведёт к активации каспазы-12, которая располагается на цитозольной стороне эндоплазматического ретикулума, вследствие транслокации белка Bim (члена семейства Bcl-2) [209]. Активация каспазы-12 ведёт к дальнейшей активации эффекторных каспаз [210]. Кроме этого, стресс эндоплазматического ретикулума может приводить к пермеабилизации митохондриальных мембран, и таким образом индуцировать классический апоптоз, а также другие митохондриально-зависимые пути клеточной смерти [211].
Выход в цитоплазму кальция во время стресса эндоплазматического ретикулума приводит к активации нейтальных цитозольных протеаз калпаинов, что также может приводить к клеточной смерти [212]. Активность калпаинов в клетке контролируется их естественным ингибитором кальпастатином, который, однако, может быть инактивирован в присутствие активированных каспаз или самих калпаинов [212]. Было показано, что активированные калпаины могут проводить к программируемой клеточной смерти, в том числе за счёт пермеабилизации лизосомных мембран [196].
Эффект микаламида А на транскрипционную активность ядерных факторов AP-1, NF-B и p53 в клетках JB6 Cl41
Таким образом, было показано, что значительная часть белков, экспрессия которых меняется под действием ааптамина на клетки, претерпевает изменения скорее на посттрансляционном, чем на транскрипционном или трансляционном уровне.
Наблюдаемое под действием ааптамина (1-50 мкМ) на NT2 клетки эмбриокарциномы человека активирование гипузинирования eIF5A с одновременным ингибированием клеточной пролиферации является первым случаем подобного эффекта, вызываемого действием низкомолекулярных веществ на клетки.
Белок eIF5A высококонсервативен во всех эукариотах и является единственным известным белком, содержащим уникальную аминокислоту гипузин (в активированной форме eIF5A) [279, 285-288]. Несмотря на то, что точный механизм действия и биологическая функция eIF5A остаются во многом неясными [274, 289, 290], все проведённые ранее исследования показывают, что наличие в клетке определенного количества гипузинированной формы eIF5A является необходимым для клеточного роста и дифференциации [260, 261, 291-293]. И наоборот, ингибирование хотя бы одной из стадий гипузинирования приводит к торможению клеточной пролиферации и отмене дифференциации [291, 292, 294].
Мы показали, что увеличение в NT2 клетках уровня гипузинированного eIF5A под действием ааптамина (1-50 мкМ) происходит без какого-либо влияния на уровни экспрессии DHS или DOHH, а также на in vitro ферментативную активность DHS, контролирующего лимитирующую стадию процесса гипузинирования. В то же время, не исключено, что ааптамин является модулятором активности DHS в живых клетках NT2, действуя через факторы, отсутствующие в нашем in vitro эксперименте по исследованию ферментативной активности DHS. Вместе с этим, активирование процесса гипузинирования под действием ааптамина на клетки NT2 может быть связано с протеасом-ингибирующей активностью ааптамина. Эффект ааптамина на eIF5A противоположен эффекту цисплатина, который вызывает аккумуляцию негипузинированного eIF5A одновременно с индукцией апоптоза (рис. 12, рис. 21Б). Это свидетельствует о том, что эффект ааптамина на eIF5A в NT2 клетках является специфическим и отличным от эффектов других, в том числе лекарственных веществ, как с точки зрения путей воздействия (не через воздействие на ферменты DHS или DOHH), так и с точки зрения результатов этого воздействия: наблюдаемое активирование гипузинирования eIF5A не только не приводит к ускорению пролиферации NT2 клеток, но даже не может отменить антипролиферативного действия на NT2 клетки нецитотоксических концентраций ааптамина.
Альфа-энолаза, один из белков, регулируемых в NT2 клетках под воздействием ааптамина, является гликолитическим ферментом, производящим АТФ при гликолизе [264]. Кроме этого, альфа-энолаза играет роль в ростовом контроле, клеточной дифференциации и в связанной с прогрессией опухолей устойчивости к гипоксии [264, 265]. Нами была выявлена происходящая под действием ааптамина регуляция нескольких изоформ альфа-энолазы, имеющих различные pI и Mw. Эти изоформы, скорее всего, являются фосфорилированными и нефосфорилированными формами этого белка. Похожие изменения соотношений изоформ альфа-энолазы были ранее обнаружены в эмбриональных стволовых клетках в процессе дифференциации, индуцируемой ретиноевой кислотой [292]. Скорее всего, ааптамин оказывает прямое или косвенное воздействие на некоторые киназы или фосфатазы, влияющие впоследствии на альфа-энолазу.
Другой регулируемый белок, кофилин-1, вовлечён в реорганизацию актина в ходе таких процессов, как движение и деление клеток, а также развитие аксонов. Неактивной формой кофилина-1 является фосфорилированная форма, которая активируется путем дефосфорилирования [266, 267]. Мы наблюдали обратный процесс – инактивацию (фосфорилирование) кофилина-1 под действием ааптамина на NT2 клетки [295]. В отличие от eIF5A, альфа-энолазы и кофилина-1, регулирование белка CRABP2 в NT2 клетках под действием ааптамина происходило на транскрипционном уровне, так как увеличение общего уровня этого белка сопровождалось увеличением концентрации соответствующей мРНК. Белки группы CRABP являются небольшими растворимыми внутриклеточными липид-связывающими белками [268]. CRABP2 функционирует как модулятор биологической активности ретиноевой кислоты [269], которая регулирует такие биологические процессы, как клеточная пролиферация, эмбриональное развитие, дифференциация и апоптоз. Интересно, что обработка ретиноевой кислотой c целью дифференциации NT2 клеток (являющихся плюрипотентными, то есть способными к дифференцировке), как и в случае с ааптамином, приводила к повышению экспрессии белка CRABP2 (Honecker, Balabanov, неопубликованные данные). Ранее сообщалось об увеличении уровня экспрессии кодирующей белок CRABP2 мРНК в дифференцирующихся NT2 клетках [296].
Таким образом, изменения, похожие на те, которые наблюдались для белков CRABP2 и альфа-энолазы при обработке NT2 клеток 50 мкМ ааптамина, ранее были идентифицированы в дифференцирующих клетках [292]. Кроме того, было показано, что для дифференцировки клеток необходимо наличие гипузинированной формы eIF5A [292].
На основании совокупности этих данных может быть сделано предположение, что обработка NT2 клеток ааптамином вносит определённый вклад в процессы дифференциации этих клеток.
По результатам проведенных экспериментов по воздействию ааптамина в концентрациях 1-50 мкМ на клетки JB6 С141 и NT2 можно предложить механизм его канцер-превентивного действия. Ааптамин проявляет канцер-превентивную активность в нецитотоксических концентрациях. Механизм действия ааптамина на трансформируемые или опухолевые клетки связан с его антипролиферативным действием, выражающимся в аресте клеточного цикла в фазе G2/М, а также с регулированием внутриклеточных уровней и активности таких белков, как эукариотический фактор инициации трансляции eIF5A, альфа-энолаза, кофилин-1 и CRABP2. Эти белки участвуют в процессах регулирования клеточного роста (eIF5A, альфа-энолаза), апоптоза, дифференциации и пролиферации (кофилин-1, CRABP2).
По результатам экспериментов по воздействию ааптамина (1) в цитотоксических концентрациях 200-400 мкМ на NT2 и JB6 С141 клетки, можно предложить механизм его цитотоксического действия. Этот эффект ааптамина реализуется через активирование фосфорилирования ERKs, с последующим увеличением транскрипционной активности АР-1 и NF-кВ ядерных факторов, активирование белка-супрессора опухолей р53 с последующей индукцией апоптоза в опухолевых клетках.
Определение способности веществ ингибировать колонеобразование опухолевых клеток в мягком агаре
Ранее было показано, что ингибирование транскрипционной активности факторов AP-1 и NF-B приводит к подавлению EGF-индуцируемой неопластической трансформации клеток JB6 P+ Cl41 [132, 313, 314]. Поэтому нами был исследован эффект микаламида А на AP-1-, NFB- и p53-зависимую транскрипционную активность в клетках JB6 Cl41 АР-1, JB6 Cl41 NF-B и JB6 Cl41 р53 со стабильно экспрессированным люциферазным репортерным геном, контролируемым AP-1-, NF-B- или p53- ДНК связывающими последовательностями, соответственно. После 6 часов обработки клеток микаламидом А в концентрациях, 1.95 - 1000 нМ наблюдалось ингибирование транскрипционной активности факторов AP-1, NF-B и p53. В то же время, в данном интервале концентраций микаламид А практически не оказывал воздействия на определённую с помощью метода MTS жизнеспособность соответствующих клеток после 6 часов обработки (рис. 41). Микаламид А ингибировал транскрипционную активность AP-1 фактора на 20-90% в интервале концентраций от 15.6 до 1000 нМ, NF-B - на 25-80% в интервале концентраций от 7.8 до 1000 нМ и р53 - на 35-60% в интервале концентраций от 3.9 до 1000 нМ (рис. 41). Примечательно, что в отличие от многих других проапоптотических веществ, обработка клеток микаламидом А приводила к ингибированию p53-зависимой транскрипционной активности, хотя при обработке клеток веществом в тех же самых концентрациях наблюдалась индукция апоптоза (рис. 41В). Данный факт может свидетельствовать о p53-независимом характере индуцируемого микаламидом А апоптоза [304].
Влияние микаламида А на AP-1- (А), NFB- (Б) и p53- (В) зависимую транскрипционную активность и жизнеспособность JB6 Cl41 клеток. Клетки были обработаны веществом в течение 6 ч. Используемые клетки стабильно экспрессируют люциферазный репортерный ген, транскрипция которого контролируется AP-1-, NFB-или p53- ДНК связывающей последовательностью. - статистически достоверное отличие от контроля (р 0.05, t-тест Стьюдента)
Похожие эффекты наблюдались для других соединений, обладающих канцер-превентивной активностью. Так, к примеру для индол-3-карбинола и некоторых флавоноидов была показана их способность индуцировать апоптоз без изменения транскрипционной активности p53 [315, 316]. В то же время следует упомянуть, что p53 способен индуцировать апоптоз независимо от своей транскрипционной активности [317, 318]. Таким образом, дальнейшие эксперименты необходимы для того, чтобы установить точную роль белка p53 в индуцируемом микаламидом А апоптозе [304].
Было исследовано влияние микаламида А на MAPK-зависимые сигнальные пути. Вестерн блоттинг анализ белкового экстракта клеток JB6 P+ Cl41, обработанных микаламидом А в течение 1 ч, выявил дозозависимую индукцию фосфорилирования киназ p38, JNK1/2 и ERK1/2 (рис. 42). Подобно микаламиду А, другие морские природные соединения, такие как, например, поликарпин и его синтетический аналог, а также сесквитерпеноид дактилон, способны активировать упомянутые выше киназы [319, 320]. Способность активировать киназы p38 и JNK1/2 была ранее описана для структурно схожих с микаламидом А соединений оннамида А и теопедерина B. Было высказано предположение, что данный эффект является важным для реализации противоопухолевой активности этих соединений [86]. Полученные в ходе выполнения настоящего исследования данные свидетельствуют о том, что микаламид А вызывает схожие биологические эффекты. Так активирование киназ p38 и JNK1/2 может быть вовлечено в индукцию микаламидом А апоптоза [321, 322]. Таким образом, было предположено, что сигнальные пути, в которых задействованы киназы p38, JNK1/2 и ERK1/2, могут принимать участие в клеточном ответе на воздействие микаламида А [304].
Рисунок 42. Воздействие микаламида А на фосфорилирование киназ p38 (А), JNK1/2 (Б) и ERK1/2 (В) в клетках JB6 P+ Cl41. Клетки были обработаны микаламидом А в течение 1 ч. Клетки, обработанные анизомицином (Анизо, 50 мкМ в течение 1 ч), были использованы в качестве положительного контроля для эксперимента по исследованию эффекта микаламида А на фосфорилирование киназ p38 и JNK1/2. Клетки, обработанные EGF (10 нг/мл в течение 15 мин) - в качестве положительного контроля для эксперимента по исследованию киназ ERK1/2.
Микаламид А (44) является перспективным веществом, обладающим выраженными цитотоксическими и канцер-превентивными свойствами и должен быть далее исследован, в том числе на моделях in vivo. Ингибирование микаламидом А EGF-индуцируемой неопластической трансформации клеток может быть, по крайней мере отчасти, объяснено даун-регулированием транскрипционной активности ядерных факторов AP-1 и NFB. В более высоких концентрациях вещество способно индуцировать апоптоз опухолевых клеток. Более того, было показано, что сигнальные пути, ассоциированные с киназами p38, JNK1/2 и ERK1/2, вовлечены в клеточный ответ на воздействие микаламида А. Исследование цитотоксической активности и механизмов действия монанхоцидина А (Mc-A) на моделях лекарственно-устойчивых герминальных опухолевых клеток
Цитотоксическую активность монанхоцдинина А (Mc-A, 59) исследовали с помощью методов MTT, и прокрашивания клеток с использованием трипанового синего. Примечательно, что герминальные опухолевые клетки, клетки рака простаты (включая устойчивые к гормональной терапии клетки PC-3 и DU145), а также клетки рака мочевого пузыря имели уровень чувствительности к Mc-A в интервале IC50 = 0.2-0.5 мкМ, в то время как нормальные клетки человека были менее подвержены цитотоксическому действию вещества (IC50 = 0.7 - 0.8 мкМ) (рис. 43, табл. 10) [323].
IC50 Mc-A и цисплатина по отношению к нескольким линиям нормальных, а также опухолевых клеток человека. Клетки были инкубированы с веществами в течение 72 ч. Представленные значения соответствуют приведённым в таблице 10. - статистически достоверное отличие значений друг от друга ( p 0.05, t-тест Стьюдента). н.д. - статистически недостоверное отличие значений друг от друга (p 0.05, t-тест Стьюдента)