Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Ферменты обмена регуляторных белков и пептидов 12
1.1. Энзимологические основы образования, модификации и деградации регуляторных пептидов 13
1.2. Характеристика протеолитических ферментов обмена регуляторных пептидов
1.2.1. Дипептидилкарбоксипептидазы 17
1.2.1.1. Пептидил-дипептидаза А 17
1.2.2. Карбоксипептидазы
1.2.2.1. Карбоксипептидаза Е 20
1.2.2.2. Фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза
1.2.3. Аминопептидазы 25
1.2.3.1. Лейциламинопептидаза 25
1.2.4. Кислые протеазы. Катепсин D 26
1.3. Роль пептидогидролаз в обмене регуляторных белков и пептидов 29
1.3.1. Общая характеристика регуляторных пептидов 29
1.3.2. Регуляторные белки
3.2.1. Гормоны белковой природы 30
1.3.2.2. Нейротрофические и ростовые факторы 31
1.3.2.3. Цитокины 41
1.4. Роль пептидергической системы в этиологии и патогенезе злокачественных новообразований 43
Глава II. Материалы и методы исследований 52
2.1. Материал и условия проведения исследований 52
2.2. Методы исследования
2.2.1. Определение активности карбоксипептидазы Е 53
2.2.2. Определение активности фенилметилсульфо-нилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы 54
2.2.3. Определение активности пептидил-дипептидазы А 54
2.2.4. Определение активности лейцин-аминопептидазы 55
2.2.5. Определение активности кислых протеаз и катепсина D 56
2.2.6. Метод определения белка 56
2.2.7. Методы статистической обработки 57
Глава III. Результаты исследования и их обсуждение 58
3.1. Изучение активности кислых протеаз 58
3.2. Изучение активности катепсина D 62
3.3. Изучение активности карбоксипептидазы Е 67
3.4. Изучение активности фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы 71
3.5. Изучение активности пептидил-дипептидазы А 75
3.6. Изучение активности лейцил-аминопептидазы 78
3.7. Корреляционный анализ активности кислых протеаз, катепсина D, карбоксипептидазы Е (КПЕ), ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ-КП), пептидил-дипептидазы А (ПДА) и лейцинаминопептидазы (ЛАП) в злокачественных новообразованиях молочной железы, желудка, кишечника, почек, печени и легких человека 82
Глава IV. Обсуждение результатов исследования 86
Заключение 95
Список литературы
- Характеристика протеолитических ферментов обмена регуляторных пептидов
- Общая характеристика регуляторных пептидов
- Определение активности фенилметилсульфо-нилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы
- Корреляционный анализ активности кислых протеаз, катепсина D, карбоксипептидазы Е (КПЕ), ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ-КП), пептидил-дипептидазы А (ПДА) и лейцинаминопептидазы (ЛАП) в злокачественных новообразованиях молочной железы, желудка, кишечника, почек, печени и легких человека
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Изучение механизмов канцерогенеза позволит значительно усовершенствовать диагностику злокачественных заболеваний и снизить смертность от рака путем повышения эффективности лечения. К настоящему времени имеется достаточно большое количество экспериментальных работ, раскрывающих роль регуляторных пептидов и белков в развитии злокачественных новообразований в организме человека (Соснина А.В., 2013, Vetvicka V, 2006, Zhou K, 2016). Описано участие ростовых факторов в процессе роста и дифференцировки опухолевых клеток (Березов Т.Т., 2009, Гомазков О.А., 2007, Zheng N., 2016), участие пептидных и белковых гормонов в перестройке метаболизма (Fu P. 2004), участие цитокинов и иммуномодулирующих пептидов в регуляции функции иммунной системы при развитии опухоли (Feng Y.X., 2010). Тем не менее, остаются вопросы о механизмах роста концентраций активных форм пептидов при развитии злокачественных новообразований. В ряде работ показано увеличение экспрессии генов, кодирующих предшественники пептидных молекул (Tang H.Y., 2012), однако концентрация биоактивных форм пептидов зависит не столько от работы генома, сколько от активности ферментов их обмена и модификации (Yamamoto H., 2011). Интерес к изучению активности протеолитических ферментов в злокачественных и доброкачественных новообразованиях вызван их комплексным участием в процессах канцерогенеза путм процессинга, модификации или инактивации регуляторных пептидов и ростовых факторов, вовлеченных в этиологию и патогенез злокачественных новообразований (Kollermann J., 2001). Предполагается исключительно высокая роль пептидгидролаз в инвазии опухолевых клеток (Zhou 2013). Тем не менее, значение пептидгидролаз в механизме канцерогенеза не до конца выяснено. Большая часть исследований выполнена на лабораторных животных (Вернигора А.Н., 2002). В связи с вышесказанным, актуальным является исследование роли пептидгидролаз в развитии злокачественных новообразований человека.
Цель исследования – исследование роли пептидгидролаз в развитии злокачественных новообразований на основании изучения закономерностей изменения активности ферментов обмена регуляторных пептидов – кислых протеаз, катепсина D, карбоксипептидазы Е (КПЕ), ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ-КП), пептидил-дипептидазы А (ПДА) и лейцинаминопептидазы (ЛАП) в опухолях молочной железы, желудка, кишечника, почек, печени и легких человека.
Задачи исследования:
-
Изучить активности пептидгидролаз в здоровых тканях и доброкачественных новообразованиях молочной железы, желудка, кишечника, почек, печени, легких человека;
-
Изучить активности пептидгидролаз в злокачественных новообразованиях молочной железы, желудка, кишечника, почек, печени, легких человека;
3. Провести корреляционный анализ полученных результатов для комплексной
оценки участия пептидгидролаз в развитии злокачественных новообразований.
Научная новизна работы
Впервые изучено распределение активности ФМСФ-КП в тканях человека. Показано повышение активности протеаз в доброкачественных опухолях, которое приводит к утрате тканеспецифического характера распределения активности ферментов, характерного для здоровых тканей. Впервые продемонстрирован рост активности комплекса пептидгидролаз в злокачественных новообразованиях различных органов. Установлено значительное, более чем на порядок, повышение активности ферментов процессинга пептидов – КПЕ и ФМСФ-КП в кишечнике, желудке, молочной железе и почках человека. На основании данных об изменении тканеспецифического характера распределения, высоком росте активностей и усилении корреляционных связей катепсина D, КПE, ФМСФ-КП сделан вывод о важности вклада протеолитических процессов, катализируемых этими ферментами, в развитие злокачественных новообразований.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты работы значительно расширяют фундаментальные представления о роли пептидгидролаз в канцерогенезе. Практический интерес представляют собой данные о существенном росте активности кислых протеаз, катепсина D, КПЕ, ФМСФ-КП, ПДА, ЛАП в злокачественных новообразованиях, что дат возможность разработки методов диагностики и лечения с использованием специфических ингибиторов ферментов. На основании полученных в рамках представленного исследования данных показана возможность применения биохимических тестов по определению активности пептидгидролаз в диагностике.
Полученные сведения об активности протеолитических ферментов в
злокачественных новообразованиях молочной железы, желудка, кишечника и почек человека включены в программу спецкурсов «Химия и биохимия протеолитических ферментов», «Биохимия и молекулярная биология», «Энзимология», «Современные методы в биохимии» и специального практикума по биохимии для бакалавров и магистров по профилю подготовки «Биохимия» в Пензенском государственном университете.
Методология и методы диссертационного исследования
При выполнении диссертационной работы были проанализированы опухолевые новообразования и здоровые ткани 160 человек, извлеченные в ходе хирургических операций в ГБУЗ Пензенский областной онкологический диспансер. Активность ферментов оценивали спектрофотометрическими и флюрометрическими методами с использованием специфических субстратов и ингибиторов. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программного обеспечения Microsoft Excel 10.
Положения, выносимые на защиту:
1. Активности ферментов обмена регуляторных пептидов - кислых протеаз, катепсина D, карбоксипептидазы E, ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы, пептидил-дипептидазы А, лейцинаминопептидазы в доброкачественных опухолях молочной железы, желудка, кишечника, почек, печени и легких человека существенно повышаются по сравнению со здоровыми тканями, что сопровождается утратой тканеспецифического паттерна в распределении активности протеолитических ферментов.
-
Развитие в протоковой карциноме молочной железы, почечноклеточном раке, аденокарциноме желудка и толстой кишки сопровождается значительным ростом активности основных карбоксипептидаз - карбоксипептидазы E и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы, в то время как не только в здоровых, органах, но и в доброкачественных новообразованиях активность данных ферментов существенно ниже.
-
Высокий рост активностей и усиление корреляционных связей катепсина D, карбоксипептидазы E, ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы свидетельствуют о важной роли этих ферментов в механизме развития злокачественных новообразований.
Степень достоверности
Достоверность результатов исследования подтверждается объемом фактического материала (160 обследованных пациентов), применением современных методик определения активности ферментов и использованием методов статистической обработки данных, полностью соответствующих поставленным задачам.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на 6 Международных и Всероссийских конференциях и съездах:
Фундаментальные и прикладные исследования в современной науке: Международная научно-практической конференция, посвященная 70-летию Победы в Великой Отечественной войне, Пенза, 2015
Российская наука в современном мире: Международная научно-практическая конференция, Москва, 2015
. Наука и современность - 2014: Международная научно-практическая конференция,
Майкоп, 2014
. Биология - наука XXI века: 18-ая Пущинская международная школа-конференция
молодых ученых, Пущино, 2014
. Культурное и историческое наследие в образовании и науке: IX Международная
научно-методическая конференция, Пенза, 2013
. V Всероссийский с международным участием медико-биологический Конгресс
молодых учных «Симбиоз-Россия 2012», Тверь, 2012
Публикации результатов исследования
По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 3 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК министерства образования и науки РФ для публикации результатов диссертационных исследований.
Структура и объём работы
Диссертация представлена на 131 страницах текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты исследования и их обсуждение, заключение, список литературы, который включает в себя 14 рисунков, 17 таблиц и библиографический список, содержащий 307 источников, из них 71 отечественных и 236 зарубежных.
Личный вклад автора
Автором лично выполнялись регистрация образцов на месте хирургического извлечения, лабораторное определение активности всех исследованных ферментов, осуществлялись статистическая обработка и анализ результатов исследования.
Характеристика протеолитических ферментов обмена регуляторных пептидов
Ангиотензинпревращающий фермент пептидил-дипептидаза А (ПДА) имеет ярко выраженные признаки пептидилдипептидазы, а также слабые трипептидилкарбоксипептидазную и эндопептидазную активность [187]. Фермент получен из тканей различных видов животных [51]. В тканях млекопитающих ПДА присутствует в соматической и тестикулярной молекулярной форме, которые различаются по физико-химическим и иммунологическим свойствам.
В состав эндотелиальной формы входят неидентичные каталитические С- и N-домены. В каждом из данных доменов находится активный центр и центр связывания Zn2+ с общей молекулярной массой 150-180 кДа [83]. Для тестикулярной формы с Mr 90-100 кДа характерно наличие одиночной полипептидной цепи и соответствие С-домену эндотелиальной формы [83]. Экспрессия представленных изоэнзимов происходит их одного гена [232]. Также в литературе встречается определение нейрональной формы фермента с Mr 170 кДа, отличающейся от эндотелиальной формы по степени гликозирования [91].
Анализ различных источников показал, что оптимум pH среды ПДА составляет 7,6-8,2, однако для проявления его максимальной активности необходимо воздействие ионов Cl- [62]. На каждый каталитический центр молекулы фермента приходится один ковалентно связанный ион Zn2+. ПДА в значительной степени ингибируется хелатирующими агентами - ЭДТА и о фенантролином – за счет брадикининпотенциирующего фактора, дитиотреитола, 2-меркаптоэтанола и додецилсульфата натрия [188]. Такие вещества как тиорфан, бацитрацин, N-этилмалеимид, пуромицин, фосфорамидон, при этом ГЭМЯК – специфичный ингибитор металл зависимых основных карбоксипептидаз не влияет на активность фермента [8, 123]. На основе данных исследований создан новый класс пептидных аналогов субстратов пептидил-дипептидазы А с константой ингибирования порядка 10-50 нМ, наиболее известными из которых являются каптоприл, еналаприл, лизиноприл [127]. In vitro ПДА способен катализировать процесс расщепления более 30 биологически активных пептидов и их предшественников [10, 132, 271]. Основные функциональные реакции это превращение ангиотензина I в ангиотензин II (Km = 4-70 мкМ), поэтапное отщепление двух дипептидов с C-конца брадикинина, расщепление неокиоторфина на киоторфин (Km = 0,58 мМ), мет-энкефалин-арг6-фен7 с образованием мет-энкефалина (Km = 0,30 мМ). Помимо этого, фермент осуществляет образование мет-энкефалин-арг6 из мет-энкефалин-арг6-гли7-лей8, способствует последовательному отщеплению двух дипептидов с C-конца динорфина A 1-8, расщеплению натрийуретического фактора из мозга и предсердий, вазопрессина, окситоцина, вещества P, вещества K, холецистокинина, нейротензина, энкефалина, нейрокинина A и B, гастрина, люлиберинабомбезина, -эндорфина, инсулина. В ряде научных публикаций последних лет утверждается, что -амилоидный пептид может подвергаться гидролизу при помощи N-концевого домена пептидил-дипептидазы А [57, 50, 306].
Вне живого организма активность ПДА может подавляться многими биологически активными пептидами и их предшественниками, к примеру, неокиоторфином, брадикинином, мет-энкефалин-арг6-фен7, веществом P, -липотропином, лей-энкефалин-арг6 и небольшой группой дипептидов[10].
В тканях животных и человека наблюдается широкая экспрессия фермента. Наиболее высокое его содержание обнаружено в легких, семенниках, почках (активность ПДА ниже, чем в легких в 25 раз), плазме крови (активность ПДА примерно в 200 раз ниже, чем в легких) [49]. Степень активности ПДА в мозге практически сопоставима с его активностью в почках [117]. Локализация фермента в синаптосомах объясняет его высокое содержание в гипофизе и стриатонигральном тракте [112]. В последнем ПДА присутствует только в нейрональной форме, поскольку связан с фракцией мембран, содержащей большое количество мускариновых рецепторов [91].
Фермент активно учувствует в процессе регуляции физиологических функций организма, обеспечивает нормальную работу сердца, легких, почек, системную регуляцию кровотока в виду преобразования ангиотензина I в ангиотензин II, являющегося выраженным вазоконстриктором, и разрушении брадикинина, проявляющего вазодилататорные свойства [187, 207]. Актуальные исследования показали, что ПДА оказывает влияние на поведенческий статус животных, путём влияния на их устойчивость к эмоционально-болевому стрессу, мотивационному поведению, агрессивности, склонности к потреблению алкоголя, принимает участие в формировании наследственной формы гипертонии, этиологии и патогенезе болезни Альцгеймера, активно вовлекается в ответ на потребление этанола и действие холиноблокаторов [25, 38, 49, 55, 64]. Ингибиторы пептидил-дипептидазы А оказывают прямое влияние на количество потребления воды и этанола, значительно усиливают обезболивающий эффектмет-энкефалин-арг6-лей7 и угнетают его распад в мозге. Кроме того, каптоприл является антидепрессантом, пролонгирует и усиливает анальгетические эффекты Met-и Leu-энкефалинов, однако данные эффекты блокирует налоксон[70, 225].
Результаты исследования дают возможность сделать вывод о наличии широкого спектра субстратной специфичности ПДА и его участии в обмене большого количества регуляторных пептидов. Активность фермента является одним из ключевых факторов, определяющих функциональное состояние всех систем живого организма.
Общая характеристика регуляторных пептидов
Цитокины – обширная группа полипептидов, синтез и секреция которых происходит при помощи активированных лимфоцитов, макрофагов, а также клеток эндотелия, эпителия либо соединительной ткани. Цитокины способны модулировать функции любых типов клеток, в том числе клеток нервной системы. Цитокины принимают непосредственное участие при формировании клеточного иммунного ответа, а также процессе возникновения острого и хронического воспаления.
1. Хемокины – цитокины, имеющие 4 группы соединений, с общей массой 8-14 кДа, различных по последовательности аминокислотных остатков и включениям цистеиновых остатков. Факторы реализуют свое действие при помощи трансмембранного рецептора (всего 7 типов), которые связаны с G-белками [240]. Экспрессия хемокинов непосредственно в клетках нервной системы существенно влияет на уровень ее развития, патогенез нейродегенеративных заболеваний [93, 283]. 2. Интерлейкины – обширная группа регуляторных белков, состоящая из около 20 подгрупп с Mr в диапазоне 8-25 кДа, которые экспрессируются, в большинстве, своем Т-клетками иммунной системы и характеризуются полимодальной активностью. Интерлейкины способствуют модуляции активности лимфоидных, миелоидных и других клеток, ускоряют рост и процесс дифференцировки тучных клеток, активированных лимфоцитов, эозинофилов [209]. Рассматривая интерлейкины как факторы про- или антивоспалительного механизма, можно сделать вывод об их причастности к большому круг патологических процессов, таких как атеросклероз, бронхиальная астма, острый респираторный синдром, гипероксия, болезнь Паркинсона, Альцгеймера и эпилепсия [78, 118]. Помимо этого, цитокины способны регулировать процесс обучения и запоминания, участвуют в стресс-реакциях [87, 273].
3. Факторы, стимулирующие рост колоний (CSF) – ростовые факторы, выполняющие функции про - или антифакторов регуляции гематопоэза. Гликопротеины, относящиеся к CSF, включают также multi-CSF, интерлейкин-5, тромбопоэтин (TPO), эритропоэтин (EPO). Основная роль факторов обусловлена соблюдением центрального контроля за выполнением половой функции. При анализе патогенеза болезни Альцгеймера, рассеянного склероза также выявлены CSF-факторы [173, 261].
4. Эфрины – цитокины, опосредующих миграцию клеток или способствующих их развитию. Отмечена экспрессия эфринов во многих отделах нервной системы, что обуславливает их отношение к формированию нейрональной сети и, в частности, к развитию отдельных нейронов [75]. Имеется информация об участии эфринов в процессе онкогенеза [136]. 1.4. Роль пептидергической системы в этиологии и патогенезе злокачественных новообразований К настоящему времени имеется достаточно большое количество экспериментальных работ, раскрывающих роль регуляторных пептидов и белков в развитии злокачественных новообразований в организме человека. Описано участие ростовых факторов в процессе роста и дифференцировки опухолевых клеток [68], участие пептидных и белковых гормонов в перестройке метаболизма [52], участие цитокинов и иммуномодулирующих пептидов в регуляции функции иммунной системы при развитии опухоли. Тем не менее, остается большое количество вопросов о механизмах увеличения концентраций активных форм данных пептидов при развитии заболевания. В ряде работ показано увеличение экспрессии генов, кодирующих предшественники данных молекул, однако концентрация биоактивных форм пептидных молекул зависит не столько от работы генома, сколько от активности ферментов их обмена и модификации [35].
Роль протеолитических ферментов в этиологии и патогенезе злокачественных новообразований к настоящему времени мало изучена, большая часть работ выполнена на экспериментальных животных и клеточных моделях.
Нокаут эксперименты с геном катепсина D показали, что гомозиготные эмбрионы мышей развивались нормально. Однако, когда мышат отнимали от грудного скармливания, они начали терять вес и умирали на 26 дне постнатального периода [260]. Два основных изменения наблюдались в тонком кишечнике (некроз и кровоизлияния) и в тимусе (увеличение апоптоза), в то время как время полураспада белков было неизменным. Это указывает на то, что катепсин D требуется в некоторых эпителиальных клетках для восстановления и обновления тканей, возможно, путем предоставления важных факторов роста. Испытания с использованием внеклеточного матрикса в качестве субстрата для определения рН оптимума катепсина Dinvitro показали рН оптимум равный 4,5-5,0 [102]. В отличие от других протеаз (например, сериновых протеаз и металлопротеиназ), у млекопитающих тканевой ингибитор не эндогенного катепсина D не описан. Пепстатин, естественный ингибитор аспарагиновых протеаз, выделенных из различных видов актиномицетов [286], который часто используется не только для очистки аффинной хроматографии катепсина D, но и для изучения некоторых функции в системах in vitro.
Различные подходы, такие как иммуногистохимия, insitu гибридизация, иммунологический анализ цитозоли, Western и Southernbolt анализы показали, что в большинстве опухолей молочной железы катепсин D сверхэкспрессируется – от 2 до 50 раз по сравнению с его концентрацией в других типах клеток, такие как фибробласты или нормальные клетки молочной железы [108]. Несколько независимых клинических исследований показали, что уровень катепсина D в цитозоле является специфичным маркером рака молочной железы [290, 255]. Мета-анализы злокачественных опухолей молочной железы [137], а также полное исследование у 2810 пациентов в Роттердаме [142] подтвердили повышенный уровень Катепсина D, что указывает на то, что этот фермент может использоваться в качестве маркера при исследовании данных опухолей.
Определение активности фенилметилсульфо-нилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы
Полученные нами данные по распределению активности ферментов обмена регуляторных пептидов и белков в доброкачественных и злокачественных новообразованиях человека вносят существенный вклад в понимание механизмов участия пептидгидролаз в этиологию и патогенез опухолей.
Учитывая специфику регионального и тканевого распределения активности КПE и ФМСФ-КП можно сделать предположение об участии данных карбоксипептидаз в процессинге нейропептидов, разных по своему аминокислотному составу. Можно предположить, что ФМСФ-КП принимает участие в процессинге форм пептидов, содержащих гидрофобную аминокислоту в качестве предшествующей отщепляемому аргинину и лизину. В отличие от нее, КПE, по-видимому, принимает участие в реакциях модификации широкой группы пропептидов с предшествующим остатком аминокислоты с коротким алифатическим радикалом (глицини аланин), но не исключительно в процессинге опиоидных пептидов, как преимущественно считалось ранее. Данное предположение дает возможностьраскрыть причину противоречий в несоответствии распределения по отделам КПE и энкефалинов.
Полученные экспериментальные данные об увеличении активности ферментов процессинга, модификации и инактивации активных форм регуляторных пептидов и белков позволяют объяснить увеличение концентрации ряда ростовых и нейротрофических факторов как в злокачественных новообразованиях, так и в плазме крови пациентов при раке различных органов [136, 296, 105], особенно в тех случаях, когда совместное определение уровней пептидных молекул и мРНК их предшественников не выявляло корреляции [68, 52].
В многочисленных исследованиях последних лет было показано, что катепсин D может выступать в качестве маркера при онкологических заболеваниях молочной железы, показана высокая роль данного фермента в процессах инвазии и метастазирования [276, 68]. В ряде работ было показано, что катепсин D стимулирует пролиферацию раковых клеток.
Наши исследования отражают существенное увеличение активности кислых протеаз и катепсина D в злокачественных новообразованиях желудка и почек, что может служить основанием разработки методики диагностики опухолей в данных органах. Поскольку в ряде работ предполагается, что катепсин D может действовать в качестве внеклеточного связывающего белка, а не как протеаза, эти методики могут быть малоинвазивными, с использованием меченых ингибиторов фермента. При этом следует отметить, что катепсин D является единственной протеазой, чья активность в злокачественных новообразованиях всех исследованных органов выше, чем в соответствующих доброкачественных опухолях.
Таким образом, при развитии злокачественных новообразований катепсин D сверхэкспрессируется и выделяется в больших количествах раковыми клетками и может способствовать не только пролиферации, но и их выживанию, а также может стимулировать подвижность и инвазию фибробластов и, следовательно, повысить опухолевой гомеостаз. Про-катепсин D, выделяемый раковыми клетками может стимулировать ангиогенез, действующий через паракринные петли в виде белка лиганда, вызывая прямое или косвенное связывание с неизвестными рецепторами клеточной поверхности, которые могут присутствовать как на раковых фибробластах, так на и эндотелиальных клетках. Обнаруженное нами, чрезвычайно выраженное увеличение активности КПЕ в злокачественных новообразованиях всех органов совпадает с результатами исследований по моделированию канцерогенеза на животных, в которых показано вовлечение данного фермента в процессинг факторов роста, которые непосредственно участвуют в развитии опухоли и метастаз [52]. Результаты исследований клеточных культур опухолей, а также опухолевой ткани человека (гепатоцеллюлярной карциномы, параганглиомы, феохромобластомы, опухоли гипофиза и легкого), удаленной после хирургического вмешательства [211] показали, что чем больше была разница между содержанием КПЕ-N в опухолевых и здоровых тканях, тем больше была инвазивность опухоли.
Таким образом, эти результаты, а также данные нашего исследования показывают, что КПЕ способствует инвазии и пролиферации опухолевых клеток exvivo и метастазирующих клеток в invivo, поэтому данный фермент может служить прогностическим биомаркером для прогнозирования протекания болезни у пациентов со злокачественными новообразованиями. ФМСФ-КП – пептидгидролаза с обширным спектром биологической активности, тем не менее, роль данного фермента исследована не до конца. Его физико-химические свойства, субстратная специфичность, распределение по тканям и органамдают основания предположить, что эта карбоксипептидаза участвует в процессинге многих биологически активных белков и пептидов, в отличие от КПЕ, участвующей в процессинге ограниченного числа биологически активных пептидов. Несмотря на сходство в субстратной специфичности данных ферментов (отщепление С-концевых лизина и аргинина), наблюдаемые отличия в распределении данных ферментов в здоровых тканях и опухолевых новообразованиях предполагают участие этих карбоксипептидаз на разных этапах механизма роста и дифференцировки клеток. По-видимому, ФМСФ-КП задействована также в модификации сигнальных молекул, рецепторов, а также ряда структурных белков.
Корреляционный анализ активности кислых протеаз, катепсина D, карбоксипептидазы Е (КПЕ), ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ-КП), пептидил-дипептидазы А (ПДА) и лейцинаминопептидазы (ЛАП) в злокачественных новообразованиях молочной железы, желудка, кишечника, почек, печени и легких человека
Также известен тот факт, что в стенках сосудов находится достаточно большое количество активатора плазминогена. Любые эндотелиальные нарушения приводят к подавлению этого процесса, что ведет к дисбаллансу в системе антикоагуляционно-коагуляционных процессов с превалированием последних. Участие пептидил-дипептидазы А в контроле кровяного давления и сосудистого тонуса осуществляется через образование ангиотензина-II, оказывающего чрезвычайно интенсивное сосудосуживающее действие. Второй механизм, связанный непосредственно с эндотелиальной дисфункцией, является следствием способности данного фермента катализировать расщепление брадикинина. Ангиотензин II представляет собой вазопрессор, приводит к образованию свободных радикалов, в том числе, супероксидных анионов, которые нивелируют эффекты NO, ведут к образованию пероксинитрита и подавляют процессы NO-опосредуемой дилатации сосудов. Таким образом, ангиотензин II ускоряет развитие эндотелиальной дисфункции, в ходе чего активируется образование прочих вазоконстрикторов и прокоагулянтов.
В результате экспериментов было выяснено, что у пациентов со злокачественными новообразования легких часто активируется система гемостаза, которая преимущественно регулируется по внешнему механизму процесса свертывания крови. Данный механизм начинается с деструкции тканей сосудов, из-за чего в кровь попадает тканевый тромбопластин, находящийся в большом количестве в легочной ткани. Это вещество активирует фактор VII в присутствии катионовкальция. Комплекс, который включает в себя фактор III, фактор VIIа, катионы кальция+ на клеточной поверхности тромбоцитов ведёт к активации фактора Х. В кровь ПДА преимущественно попадает из легких. При пульмонологических операциях, по-видимому, выход ПДА в кровь усиливается, что обуславливает генерализованный синтез ангиотензина II, принимающего участие в агрегации тромбоцитов, на мембране которых осуществляется механизм внешнего пути свертывания крови. Помимо этого, в результате операционного вмешательства происходит выброс факторов свертывания крови, а также нарушение целостности стенок сосудов, что в свою очередь ведет к изменению активности ПДА, поскольку данный фермент участвует в образовании коллагена и может способствовать фиброзу, активируя систему свертования, компонентом которой является протромбин.
При интенсивном росте злокачественных клеток активизируется работа системы вторичных внутриклеточных мессенджеров в виде G-белков и 3 ,5 АМФ и -ГМФ-циклазы [111, 121]. В результате этого в клетках образуется большое количество вторичных мессенджеров – циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) и циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). Данные молекулы способствуют выбросу содержимого из секреторных везикул [106]. Поэтому нельзя исключить, что в процессах регуляции карбоксипептидазной активности при злокачественном росте опухоли препаратов участвуют цАМФ- и цГМФ-зависимые механизмы.
Многочисленные мембранные и внутриклеточные процессы ведут к раскрытию ионных каналов плазматических мембран и усиливают степень фосфорилирования остатков тирозина в белках [208]. Ростовые факторы, количество которых повышено при канцерогенезе, участвуют в регуляции внутриклеточной концентрации ионов кальция [208]. Ионы Ca2+активируют выброс содержимого секреторных везикул влияя на процессы слияния везикул с плазматическими мембранами. Несмотря на то, что ионы кальция in vitro не влияют на активность КПЕ [156,158], в составе фермента обнаружен участок связывания данных ионов. Ионы кальция способствуют агрегации КПЕ и переход в мембрансвязанную форму [155]. Встречается много предположений, что биологические функции растворимой и мембраносвязанной формы КПЕ существенно отличаются [17, 155]. Предполагают, что обе формы данного фермента участвуют в процессинге регуляторных пептидов, но связанная с мембранами форма, помимо этого, может принимать участие во внутриклеточной сортировке пептидов [17, 155, 157]. Кроме того, встречаются данные, что активность прогормонконвертазы – фермента, участвующего в процессинге про КПН, регулируется ионами Ca2+ [157, 159]. Изложенное выше позволяет предположить, что механизм повышения активности карбоксипептидазы Е может быть опосредован изменениями внутриклеточной концентрацией ионов Ca2+. Это может приводить как к изменению уровня активности фермента, так и к изменению соотношения растворимой и мембраносвязанной форм, что в свою очередь влияет на процессинг и сортировку биологически активных пептидов.
Стероидные гормоны, такие как глюкокортикоиды, влияют на уровень экспрессии многих генов. Есть данные, что глюкокортикоиды оказывают влияние на уровень экспрессии мРНК КПЕ [157]. Дексаметазон уменьшает концентрацию мРНК КПЕ в клетках AtT-20 [151]. Известно, что при канцерогенезе локально изменяется уровень кортизола и альдостерона. Поэтому можно предположить, что повышение активности КПЕ и ФМСФ-КП обусловлено повышением уровня экспрессии генов данных ферментов.
Основываясь на результатах собственных исследований, а также имеющихся данных литературы мы попытались в заключение разработать обобщенную схему функционального участия пептидгидролаз в этиологии и патогенезе злокачественных новообразований (рис. 14). Механизм активации пептидгидролаз при канцерогенезе является каскадным и самоактивируемым, и заключается, по-видимому, в воздействии на синтез мРНК ферментов через систему вторичных мессенджеров - цАМФ- и цГМФ-зависимые механизмы, влияние ионов Ca2+ и действие ростовых факторов, синтез и модификация которых повышается при участии данных пептидгидролаз.
Ответ организма на развивающиеся изменения метаболизма заключается в активизации процессов синтеза и модификации пептидных регуляторов, повышенный уровень которых обеспечивает интенсификацию процессов роста и развития опухоли.