Введение к работе
Актуальность темы. Представители тропического растения рода Rauwolfla L. семейства Аросупасеае являются продуцентами свыше 100 алкалоидов, многие из которых используются в медицине и обладают ярко выраженным фармакологически активным действием. Корни трех видов раувольфии: R. serpentina Benth, R. canescens L. и R. vomitona Afz. служат основным лекарственным сырьем для получения ряда высоко эффективных препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний ( резерпин, иохимбин, аймалин, аймалицин). Особое место среди них занимает аймалин, проявляющий высокую противоа-ритмическую активность. Несмотря на важную значимость этого алкалоида для медицинской практики в нашей стране он не производится. Его получение было налажено на Украине на харьковском НПО "Здоровье трудящихся" из импортных корней раувольфии змеиной и раувольфии рвотной. В настоящее время производство аймалина на Украине прекращено и потребность в препаратах раувольфии в нашей стране удовлетворяется лииь частично за счет импорта.
В последние годи определились перспективы для биотехнологического подхода к решению данной проблемы, базирующиеся на методе культуры изолированных тканей и органов растений. Так, на Оазе Ленинградского химико-фармацевтического института (ныне СПХФИ) был создан высокопродуктивный штамм К27 калдусной культуры ткани раувольфии змейкой стеблевого происхождения - продуцент аймалина. Однако, основной задачей остается повышение продуктивности культивируемых клеток данного штамма. Одной из причин, приводящих к снижению содержания конечного продукта биосинтеза - аймалина в ткали, выступает сильная аккумуляция его ацетилированных предшественников. По этой причине особенно перспективной и актуальной является проблема изучения ферментных систем, осуществляющих превращение ацетилированных интермедиатов, а также механизмов регуляции этих процессов. В связи с тем, что в штамме К27 культуры ткани раувольфии змеиной наблюдается повышенное, по-сравнению с другими алкалоидами аймадинового пути, накопление ацетилаймалина, наибольший интерес представляет исследование последнего фермента биосинтеза - ацетиаймалинзстеразы (ААЗ), катализирующей реакцию гидролиза ацетидаймалина до конечного продукта биосинтетического пути - аймалина.
Целью работы является изучение активности, свойств и параметров объмена ацетилаймалинэстеразы в штамме К27 культуры ткани раувольфии змеиной.
Задачи исследования
-
Изучение динамики активности ААЭ, концентрации белка, массы ткани, содержания аималина и индолиновых алкалоидов в процессе культивирования биомассы. Исследование зависимости уровня накопления аималина от уровня активности ААЭ.
-
Изучение спектра алкалоидов и ферментов их синтеза, относящихся к классу эстераз, в культуре ткани раувольфии змеиной.
-
Разработка метода выделения аималина из культивируемых клеток.
-
Разработка метода выделения и очистки ААЭ.
-
Изучение физико-химических и кинетических свойств ААЭ.
-
Изучение обмена ААЭ в культуре ткани раувольфии змеиной.
В предлагаемой работе был выделен и охарактеризован последний фермент аймалинового пути, осуществляющий ацетилаймалина с образованием аималина и уксусной кислоты - ААЭ. Данные, касающие* ся исследованию ААЭ, представляют особый интерес, поскольку в нашей стране не проводилось ранее работ, связанных с изучением отдельных ферментов биосинтеза аималина. и в частности ААЭ, а результаты подученные в институте фармацевтической биологии университета города Мюнхена в Германии в большинстве случаев значительно отличаются от полученных нами.
В диссертационной работе впервые показана зависимость между активностью ААЭ и содержанием аималина. наличие мембраносвязанной формы данного фермента, аллостерическая природа и олигомерная структура ААЭ.
В настоящей работе представлены данные по обмену ААЭ в штамме К27 каллусной культуры ткани раувольфии змеиной: определены константы синтеза и деградации, время "подужизни" и концентрация фермента в пассируемой культуре.
Был разработан метод определения суммарной зстеразной активности, позволяющий количественно расчитать содержание ферментов данного класса в биомассе раувольфии змеиной.
С целью установления спектра и количества индивидуальных алкалоидов в исследуемых образцах был предложен способ анализа проб методом ВЖХ.
Разработан новый метод выделения и очистки аймалина из культуры ткачи раувольфии змеиной с использованием колоночной хроматографией на аффинном адсорбенте.
Теоретическая и практическая значимость. Диссертационная работа имеет как практическое, так и теоретическое значение. Первое связано, прежде всего, с разработкой нового метода выделения аймалина из культивируемых клеток раувольфии змеиной с помощью колоночной хроматографии на аффинном адсорбенте (ААТФ) типа азоад-сорбент (АЗС). Предложенный способ выделения этого алкалоида позволяет значительно сократить число стадий, необходимых для его получения в гомогенном состоянии, существенно уменьшить число операций, требующих использования вредных органических растворителей, а также повысить выход конечного продукта.
Теоретическое значение работы связано с исследованием метаболизма ЛДЗ з штамме К2? культуры ткани раувольфии змеиной. Был впервые исследован обмен АДЗ в пассируемой культуре раувольфии змеиной, результаты которого углубляют наши знания об обмене индивидуальных белков в культуре растительной ткани. Полученные данные содержат информацию о скорости синтеза, распада, времени "полужизни" и содержании фермента в ткани. Результаты исследования физико-химических и кинетических свойств ААЭ, последнего фермента, принимающего участие в формировании аймалина - конечного продукта сложной цепи биосинтетических превращений, дополняют наши представления о путях и механизмах его образования, а также позволяют не только охарактеризовать ААЭ, но и предположить определенную регуляторную роль этого фермента в процессе биосинтеза аймалина. Кроме того, оценка метаболизма культивируемых клеток растений создает определенную теоретическую базу для направленного синтеза вторичных соединений, являющихся ценными лекарственными препаратами, а изолирование и изучение свойств ферментов, ведущих основные реакции образования этих метаболитов, может стать необходимой предпосылкой для осуществления внеклеточного синтеза ряда важных фармакологически активных веществ растительного происхождения.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 149 страницах, содержит 14 таблиц и 30 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов
и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, который включает в себя Т'Я наименований, из которых - 103 на иностранных языках.