Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Роль липидов в метаболизме животных 14
1.1.1. Фосфолипиды 15
1.1.2. Холестерин, его функциональное значение 19
1.1.3. Триацилглицерины, эфиры холестерина и воска 22
1.1.4. Жирные кислоты 23
1.2. Липиды в биохимических механизмах адаптации рыб в процессе роста и развития в условиях Арктики и Субарктики 26
1.3. Липиды и жирные кислоты в раннем развитии рыб северных широт 31
1.4. Ранний онтогенез костистых рыб 40
1.4.1. Типы и периодизация 40
1.4.2. Особенности раннего развития люмпена пятнистого как одного из ключевых представителей арктической ихтиофауны 43
Глава 2. Материал и методы исследования 50
2.1. Материал исследования 50
2.1.1. Район сбора проб – Конгсфьорд, о. Западный Шпицберген 52
2.2. Методы исследования 60
2.2.1. Фиксация материала 60
2.2.2. Экстракция 60
2.2.3. Тонкослойная хроматография 61
2.2.4. Методы количественного определения липидов 62
2.2.5. Высокоэффективная жидкостная хроматография 64
2.2.6. Газовая хроматография: определение спектра жирных кислот 65
2.3. Расчеты количества липидов в пробе и статистическая обработка данных 67
Глава 3. Результаты исследований 69
3.1. Содержание общих липидов и их классов в мышцах молоди люмпена пятнистого (стадии развития L1–L5) 69
3.2. Жирнокислотный спектр общих липидов мышц молоди люмпена пятнистого (стадии развития L1–L5) 72
3.3. Жирнокислотный спектр фосфолипидов и триацилглицеринов мышц молоди люмпена пятнистого (стадии развития L1–L5) 80
3.4. Содержание общих липидов и их классов в липидном мешке молоди люмпена пятнистого на стадиях развития L3, L4, L4 88
3.5. Жирнокислотный спектр общих липидов липидного мешка молоди люмпена пятнистого на стадиях развития L3, L4, L4 91
3.6. Жирнокислотный спектр фосфолипидов и триацилглицеринов липидного мешка молоди люмпена пятнистого на стадиях развития L3, L4, L4 97
3.7. Жирнокислотный спектр общих липидов в мышцах взрослых особей люмпена пятнистого 102
Глава 4. Обсуждение результатов 104
Заключение 123
Выводы 126
Список литературы 128
- Липиды в биохимических механизмах адаптации рыб в процессе роста и развития в условиях Арктики и Субарктики
- Район сбора проб – Конгсфьорд, о. Западный Шпицберген
- Жирнокислотный спектр общих липидов мышц молоди люмпена пятнистого (стадии развития L1–L5)
- Жирнокислотный спектр фосфолипидов и триацилглицеринов липидного мешка молоди люмпена пятнистого на стадиях развития L3, L4, L4
Введение к работе
Актуальность темы. Липиды являются важнейшими структурными и
функциональными компонентами всех живых систем. Они играют роль
структурной основы любой биологической мембраны, обеспечивают
энергетические потребности организма. Многие липиды являются биологически активными веществами или их предшественниками, участвующими в регуляции многообразных физиолого-биохимических процессов (Алесенко, 1998; 2013; Дятловицкая, Безуглов, 1998; Сергеева, Варфоломеева, 2006; Перевозчиков, 2008; Lagarde et al., 2016).
Липиды считаются незаменимыми компонентами в реализации комплекса сформировавшихся в эволюции биохимических адаптаций, направленных на запуск компенсаторных реакций клетки, поэтому изменения липидного статуса в процессе индивидуального развития организма могут отражать состояние популяций животных, в том числе гидробионтов – эктотермных организмов, развитие которых происходит в постоянно изменяющихся условиях среды (Хочачка, Сомеро, 1988; Hochachka, Somero, 2002). Липиды определяют репродуктивные процессы, рост, развитие и выживаемость рыб, могут выступать в качестве дополнительных биохимических индикаторов их состояния на любой стадии онтогенеза (Мацук, Лапин, 1972; Мацук, 1975; Tocher, 2003; 2010). Следует отметить, что липидный и жирнокислотный состав представителей арктической ихтиофауны исследован недостаточно, тогда как системное изучение биохимии и физиологии ключевых видов морских приполярных экосистем очень важно для раскрытия особенностей механизмов биохимических адаптаций у арктических видов в раннем онтогенезе. Кроме того, в современных условиях повышенного интереса к Арктике результаты работы могут иметь значение при разработке государственных стратегий по освоению и развитию данного региона, для решения экологических проблем, связанных с повышенной чувствительностью рыб к климатическим изменениям.
Исследуемый в работе объект – представитель придонной арктической ихтиофауны – люмпен пятнистый Leptoclinus maculatus (Fries, 1838) из семейства Стихеевых (отряд Окунеобразные), который распространен в Арктике вплоть до 79 с.ш. и обитает при низких температурах от –1,2 до 2,0 С и высокой солености – 33–35 (Андрияшев, 1954; Нельсон, 2009; Mecklenburg et al., 2011). Он имеет большое значение как промежуточное звено в арктических трофических цепях, где выступает одновременно в роли хищника и жертвы. Люмпен является ценным высокоэнергетическим объектом питания для многих видов рыб, птиц и млекопитающих (Barret, 2002; Weslawski et al., 2006; Labansen et al., 2007).1
1ОЛ – общие липиды; ФЛ – фосфолипиды; ФИ – фосфатидилинозит; ФС – фосфатидилсерин; ФХ – фосфатидилхолин; ФЭА – фосфатидилэтаноламин; СФМ – сфингомиелин; ЛФХ – лизофосфатидилхолин; ТАГ – триацилглицерины; ХС – холестерин; ЭХС – эфиры холестерина; В – воска; ЖК – жирные кислоты; НЖК – насыщенные ЖК; МНЖК – мононенасыщенные ЖК; ПНЖК – полиненасыщенные ЖК; ДГК – докозагексаеновая кислота; ЭПК – эйкозапентаеновая кислота; (n-x) – положение двойной связи от конечной метильной группы в молекуле ЖК, где x – номер углеродного атома, от которого начинается первая двойная связь.
Люмпен пятнистый уникален многостадийным и длительным развитием со сменой зоны обитания. Молодь люмпена развивается в пелагиали до 3-летнего возраста, а затем становится ювенильной особью, ведущей придонный образ жизни, в возрасте около 5 лет (Meyer Ottesen et al., 2011). Уникальной особенностью личинок люмпена является наличие специального образования в брюшной части тела, провизорного органа – так называемого «липидного мешка». Среди представителей арктической ихтиофауны липидный мешок обнаружен только у рыб семейства Стихеевых и детально описан на примере люмпена пятнистого (Falk-Petersen et al., 1986a; Мурзина, 2010). Он выполняет, в первую очередь, запасную функцию, аккумулируя большое количество липидов, а также обеспечивает плавучесть личинок.
Следует отметить, что к настоящему времени сведения об онтогенезе люмпена пятнистого Leptoclinus maculatus (Fries, 1838), его питании и росте немногочисленны (Falk-Petersen et al., 1986a; Murzina et al., 2008; 2012; 2013a; Мурзина, 2010; Meyer Ottesen et al., 2011). Данная работа является продолжением и развитием исследований по липидному составу люмпена, результаты которых представлены в основном в наших работах и в статьях норвежских коллег (Falk-Petersen et al., 1986a; Murzina et al., 2008; 2012; 2013a,b; Мурзина, 2010; Мурзина и др., 2010; Meyer Ottesen et al., 2011; Пеккоева и др., 2017а,б).
Изучение динамики содержания липидов и жирных кислот как структурных, так и энергетических липидов в мышцах и в липидном мешке люмпена пятнистого в процессе постэмбрионального развития позволит получить новые данные об особенностях липидного обмена, механизмов биохимических адаптаций с участием липидов в процессе развития рыб в условиях биотических (питание) и абиотических факторов среды высоких широт.
В связи с вышеизложенным, были определены следующие цели и задачи исследования.
Цель исследования:
изучить динамику содержания липидов и их жирнокислотных компонентов в мышцах и в липидном мешке молоди люмпена пятнистого Leptoclinus maculatus, обитающего в заливе Конгсфьорд архипелага Шпицберген, в процессе постэмбрионального развития и роста.
Задачи исследования:
Провести сравнительный анализ количественного и качественного состава
липидов и их отдельных классов – фосфолипидов (в том числе
фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина,
фосфатидилинозитола, лизофосфатидилхолина, сфингомиелина), холестерина, триацилглицеринов, эфиров холестерина в мышцах и в липидном мешке люмпена пятнистого на стадиях раннего постэмбрионального развития L1, L2, L3, L4, L4*, L5;
Провести сравнительный анализ спектра жирных кислот структурных (фосфолипидов) и запасных (триацилглицеринов) липидов в мышцах и в липидном мешке люмпена пятнистого на стадиях раннего постэмбрионального развития L1, L2, L3, L4, L4*, L5 и в мышцах взрослых особей;
Установить особенности поступления жирных кислот по трофическим цепям от фито-, зоопланктона и донных беспозвоночных к люмпену пятнистому в процессе его развития и их влияние на процессы роста молоди рыб.
Научная новизна. Впервые получены данные о динамике содержания отдельных классов липидов и жирных кислот структурных и энергетических липидов в мышцах и в липидном мешке молоди люмпена пятнистого Leptoclinus maculatus (Fries, 1838) из Конгсфьорда (арх. Шпицберген) на стадиях его раннего постэмбрионального развития L1, L2, L3, L4, L4*, L5 в зимний период. Установлено, что уровень полиненасыщенных жирных кислот понижается, а мононенасыщенных жирных кислот повышается в процессе развития молоди люмпена от L1 к L5 стадии развития. Впервые установлена связь между содержанием липидов и жирных кислот структурных и энергетических липидов в мышцах и в липидном мешке и питанием в раннем онтогенезе люмпена в условиях полярной ночи. Показано, что содержание мононенасыщенных жирных кислот в составе триацилглицеринов мышц люмпена значительно повышается в процессе его постэмбрионального развития, что связано со сменой зоны обитания и характера питания: высокий уровень 22:6(n-3), 18:1(n-9) жирных кислот у пелагических личинок на стадии развития L1 – с питанием динофитовыми водорослями в составе фитопланктона; высокое содержание биомаркерных 22:1(n-11), 20:1(n-9) жирных кислот со стадии развития L2 – с началом активного питания зоопланктоном рода Calanus; 18:1(n-9), 18:1(n-7), 16:1(n-7) жирных кислот у взрослой придонной рыбы – с питанием беспозвоночными бентоса. Впервые показано, что одним из признаков, вносящих вклад в фенотипическую разнокачественность молоди люмпена, является установленное различие в содержании жирных кислот – 14:0, 16:0, 18:0, 16:1(n-7), 18:1(n-9), 20:1(n-9), 22:1(n-11), 18:2(n-6), 20:4(n-6), 18:3(n-3), 20:5(n-3), 22:5(n-3), 22:6(n-3).
Основные положения, выносимые на защиту:
Качественный и количественный состав липидов и жирных кислот молоди
люмпена пятнистого определяет его сходство с другими видами морской
холодноводной ихтиофауны (высокое содержание длинноцепочечных
полиненасыщенных жирных кислот n-3 семейства, нейтральных липидов), при этом имеются специфические особенности – высокий уровень моноеновых жирных кислот, в основном в виде биомаркерных жирных кислот калянусов – 20:1(n-9), 22:1(n-11);
Изменение жирнокислотного состава в постэмбриональном развитии люмпена пятнистого отражает особенности его питания: высокий уровень 22:6(n-3), 18:1(n-9) жирных кислот на стадии L1 указывает на питание динофитовыми водорослями в составе фитопланктона; высокое содержание 20:1(n-9) и 22:1(n-11) жирных кислот со стадии развития L2 – на начало активного питания зоопланктоном рода Calanus; жирных кислот 18:1(n-9), 18:1(n-7), 16:1(n-7); у взрослого люмпена – на питание беспозвоночными бентоса.
Теоретические и практическое значение работы. Результаты детального исследования липидного состава в раннем постэмбриональном развитии одного из ключевых видов арктических экосистем – люмпена пятнистого L. maculatus, помимо фундаментального значения для получения новых знаний о липидном составе в раннем онтогенезе рыб, о взаимоотношениях организма и среды (в том числе для биохимии, физиологии, биологии развития, экологии), могут быть использованы в решении ряда практических задач, связанных, например, с оценкой продуктивности ценных промысловых видов рыб (атлантическая треска, полярная треска, камбала), для которых пелагическая молодь люмпена является высокоэнергетическим источником питания. Данные о составе жирных кислот экологически значимого вида – люмпена пятнистого, могут быть использованы и при составлении кормов для эффективного выращивания рыб северных регионов в аквакультуре, с учетом того, что в последнее время активно развивается направление культивирования холодноводных морских рыб (Журавлева, 1996; Svasand et al., 2004), а также при разработке биологически активных веществ особой ценности. Результаты работы могут быть использованы в комплексной эколого-биохимической индикации состояния ихтиофауны арктического региона на организменном и популяционном уровне и для оценки приспособительных возможностей у гидробионтов северных широт при определении границ их толерантности в условиях изменения климата.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены в виде 9 устных и 8 стендовых докладов: на Международном конгрессе «International Congress on the Biology of Fish» (Эдинбург, 2014); II Всероссийской Интернет-конференции с международным участием «Липидология – наука XXI века» (Казань, 2014); на международных конференциях «Комплексные исследования природы Шпицбергена и прилегающего шельфа» (Мурманск, 2014); «Arctic Change 2014» (Оттава, 2014); «Arctic Frontiers 2015 – Climate & Energy» (Troms, 2015); «Gordon Research Conference. Polar Marine Science» (Лукка, 2015); «39th Annual Larval Fish Conference» (Вена, 2015); «Функционирование и динамика водных экосистем в условиях климатических изменений и антропогенных воздействий» (Санкт-Петербург, 2015); «57th International Conference on the Bioscience of Lipids» (Chamonix - Mont Blanc, 2016); XXVIII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2016); Российско-финском научном семинаре «Biochemical biomarkers for environmental bioindication and biomonitoring» (Петрозаводск, 2016); Конгрессе Университета Арктики (UАrctic-2016) (Санкт-
Петербург, 2016); XV Всероссийском совещании с международным участием по эволюционной физиологии, посвященных памяти академика Л.А. Орбели и 60-летию ИЭФБ РАН (Санкт-Петербург, 2016); Annual meeting SEB (Gothenburg, 2017); на международных конференциях «Живая природа Арктики: сохранение биоразнообразия, оценка состояния экосистем» (Архангельск, 2017); «Young Biologists Science Week-2017» (Петрозаводск, 2017).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 работ, их них 5 статей в рецензируемых научных журналах, в том числе рекомендованных ВАК для публикации результатов научных исследований, и 22 тезиса и материалов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав: обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, а также заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 164 страницах, документирована 26 рисунками, 17 таблицами. Список литературы содержит 309 источников, из них 174 иностранные.
Личный вклад. Автор принимал участие лично во всех этапах подготовки диссертационной работы: при постановке и решении цели и задач исследования, проведении экспериментов, сборе полевого материала, статистической обработке и анализе данных, в подготовке публикаций на основе полученных результатов.
Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность и благодарность преподавателям и наставникам: научному руководителю – д.б.н., проф., чл.-корр. РАН Н.Н. Немовой, научным консультантам – к.б.н. С.А. Мурзиной, к.б.н. З.А. Нефедовой, а также другим сотрудникам лаборатории экологической биохимии ИБ КарНЦ РАН – д.б.н. А.Л. Рабиновичу, д.б.н. Л.П. Смирнову, к.б.н. П.О. Рипатти, к.б.н. Т.Р. Руоколайнен, главному химику Л.В. Марковой. Отдельная благодарность д.б.н., проф. Е.П. Иешко за ценную профессиональную помощь, научные дискуссии по работе с публикациями. Глубокая благодарность к.б.н., проф. С. Фальк-Петерсену, д.б.н., проф. Й. Берге, к.б.н., проф. О.Й. Лонне за ценные советы и всестороннюю помощь в организации экспедиций на норвежском научном судне «Helmer Hanssen» (UiT), а также автор выражает признательность судовой команде «Helmer Hanssen».
Исследование проводилось при поддержке программы Президента РФ «Ведущие научные школы» НШ-1410.2014.4, Программы Президиума РАН, проекта «Эколого-биохимическая характеристика устойчивости гидробионтов Арктической зоны России в условиях изменения климата» (№ 0221-2016-0001), РФФИ (№ 17-04-00466), международного проекта «Timing of ecological processes in Spitsbergen fjords».
Липиды в биохимических механизмах адаптации рыб в процессе роста и развития в условиях Арктики и Субарктики
Липиды являются ключевыми компонентами в реализации эволюционно сформированных адаптаций, направленных на запуск компенсаторных реакций в организме (Хочачка, Сомеро, 1988; Hochachka, Somero, 2002). Липиды – генетически некодируемые соединения, однако набор определенных классов липидов в клетке генетически детерминирован (Крепс, 1981). Их количественное содержание зависит не только от особенностей обмена липидов организма, но и от влияния на него физиологических и экологических факторов (Шатуновский, 1980; Аврова, 1999; Мурзина и др., 2009; Мурзина, 2010; Lloret et al., 2014; Немова и др., 2015).
Липиды являются важными параметрами в установлении взаимосвязи путей клеточного метаболизма, задействованных в развитии биохимических компенсаторных реакций у рыб и водных беспозвоночных (Шатуновский, 1980; Шульман, Юнева, 1989; Немова и др., 2015). Обитание рыб в морских экосистемах Арктики, особенно молоди, которая наиболее чувствительна к флюктуациям параметров окружающей среды, предполагает адаптации к стабильно низким температурам, сезонному изменению освещенности (полярный день и ночь), передвижению и перемешиванию различных водных масс, вариациям уровня ледового покрова (Nemoto, Harrison, 1981; Falk-Petersen et al., 1990, 2007; Kattner, Hagen, 1995; Hop et al., 2006; Kattner et al., 2007; Кауфман, 2015). Известно, что температура среды сильно влияет на все обменные процессы и, особенно, на обмен липидов (Крепс, 1981; Лось, 2001).
Одним из механизмов адаптаций у видов северных широт является накопление липидов как основных источников энергии (в отличие от экваториальных видов, использующих в этих целях углеводы (Кауфман, 2015). У гидробионтов полярных широт, в том числе рыб, отмечены высокие показатели запасания липидов в отличие от организмов умеренных и тропических областей (Кауфман, 2015). Согласно гипотезе «метаболической холодоадаптации» у пойкилотермных животных полярных, бореальных и тропических областей физиологические процессы протекают с одинаковой скоростью. Однако было показано (Карамушко, 2008; Карамушко, Шатуновский, 2009), что адаптация животных к жизни в низкотемпературных условиях заключается не в повышении энергетического обмена, а в общем снижении потребления годовой энергии и в более высокой эффективности продуцирования вещества (Карамушко и др., 2004). Для гидробионтов полярных широт по сравнению с таковыми из умеренных широт характерны более низкая интенсивность метаболизма, что позволяет повысить степень использования пищи и увеличить эффективность ростовых процессов, что энергетически целесообразно для жизни в высоких широтах (Карамушко, 2001, 2007, 2008, 2014; Карамушко, Шатуновский, 2009; Кауфман, 2015).
Температурные адаптации включают как фенотипические, так и генотипические механизмы: биологические антифризы, уменьшение вязкости мембранных липидов за счет изменения их состава, замена аминокислот, приводящая к уменьшению жесткости молекул белков, низкая энергия активации ферментов, синтез белков холодового шока, удаление внутриклеточной воды, увеличение внутриклеточной концентрации глицерина, компенсация уровня дыхания и массы митохондрий (Озернюк, 2000, 2003). Среди факторов внешней среды температура оказывает наибольшее воздействие на физические параметры биологических мембран, вызывая изменения в количестве и структуре липидных компонентов (Сидоров, 1983; Озернюк, 2000; Graeve et al., 2001; Рабинович, 2008; Веланский, 2010).
Современное представление о процессах адаптации к изменениям температуры на уровне мембран основано на концепции «гомеовязкости», предполагающей поддержание жидкокристаллического состояния липидного матрикса, необходимого для оптимального функционирования биомембран клеток при изменении температур (Hochachka, Somero, 2002; Болдырев и др., 2006; Рабинович, 2008; Веланский, 2010). Микровязкость липидного бислоя определяет процесс подвижности рецепторов плазматической мембраны, формирующих специфические биохимические сигналы и передающих их внутрь клетки при разных температурных условиях (Лопухин и др., 1985; Рабинович и др., 2007).
Среди биохимических механизмов поддержания гомеостаза организмов при изменении температуры окружающей среды является изменение ЖК состава клеточных мембран (Крепс, 1981; Болдырев, 1985; Hochachka, Somero, 2002; Болдырев и др., 2006; Николлс и др., 2008; Arts, Kohler, 2009). Для рыб характерно увеличение степени ненасыщенности ЖК радикалов ФЛ при адаптации мембран к более низким температурам, и, наоборот, повышение температуры среды способствует понижению их ненасыщенности (Hazel, Carpenter, 1985; Сидоров, 1983; Лось, 2001; Hochachka, Somero, 2002; Болдырев и др., 2006; Arts, Kochler, 2009). Увеличение количества длинноцепочечных ненасыщенных ЖК обеспечивается работой элонгаз и десатураз (Ленинджер, 1985; Крепс, 1981; Кольман, Рем, 2009). На активность десатураз (5 и 6) оказывает влияние, в том числе наличие молекулярного кислорода, количество которого в полярных водах значительно выше, чем в экваториальных (Костецкий и др., 2008).
Высоконенасыщенные ЖК способны быстро включаться в адаптивные реакции организма (Гершанович и др., 1991; Gladyshev et al., 2009; Nefedova et al., 2014). Этим, в том числе, объясняется преобладание у гидробионтов северных широт ПНЖК, особенно семейства (n-3) (Visentainer et al., 2007; Bell, Tocher, 2009; Tocher, 2010; Burri et al., 2012; Giraldo et al., 2015), обеспечивающих более высокую степень ненасыщенности мембран по сравнению с семействами (n-9) и (n-6) ПНЖК (Крепс, 1981; Сидоров, 1983; Cejas et al., 2004). Морские холодноводные рыбы (например, лосось, сардина, сельдь, макрель) содержат большое количество ПНЖК n-3 семейства, особенно 20:5(n-3) ЭПК и 22:6(n-3) ДГК (Burri et al., 2012), тогда как тропические и пресноводные виды отличаются более высоким содержанием МНЖК, повышенным содержанием ПНЖК n-6 семейства (Henderson, Tocher, 1987; Deibel et al., 2012). У атлантического лосося более чем 30% ЖК представлено ЭПК и ДГК (Burri et al., 2012). Содержание ЖК n-3 семейства, главным образом ЭПК и ДГК, у эндемичных антарктических рыб крокодиловой белокровки Chaenocephalus aceratus и гололобой нототении Notothenia neglecta составляет 45% суммы ЖК (Visentainer et al., 2007). У рыб северных регионов, в составе отдельных ФЛ отмечен более высокий уровень 18:1(n-9) ЖК, что указывает на её важность при температурных адаптациях (Забелинский и др., 1995). У рыб, обитающих при более низких температурах, уровень отдельных ФЛ и ХС в составе мембран тканей выше, чем у таковых, живущих в более теплых условиях (Miller et al., 1976; Гершанович и др., 1991). При адаптации организмов к низким температурам показатель ФХ/ФЭА понижается, а уровень ненасыщенности жирнокислотных компонентов в ФЭА повышается, что оказывает влияние на физико-химические свойства мембраны: ее структура перестраивается, что сохраняет оптимальную работу всех мембраносвязанных ферментов и ионных каналов (Hazel, Carpenter, 1985; Hochachka, Somero, 2002; Веланский, 2010). Известно, что ФЭА способствует адаптации организма к резким изменениям температуры (Desvilettes et al., 1997; Tillman, Cascio, 2003).
Границы температур, в которых рыбы могут развиваться и проявлять биологическую активность, определяются эффективностью адаптивных ответов, прежде всего, на метаболическом уровне (Озернюк, 2000, 2003). Изменение температурного оптимума в течение эмбрионального и личиночного развития может быть связано с особенностями протекания метаболических процессов во время дифференцировки тканей и органов, а также в процессе компартментализации внутриклеточных процессов, которая определяет характер распределения веществ, участвующих в регуляции различных биохимических и физиологических реакций (Озернюк, 2000, 2011, 2016).
Таким образом, липиды и их ЖК компоненты играют значительную роль в биохимических адаптациях организмов высоких широт, выступая источниками энергии и поддерживая необходимую жидкостность биомембран клеток для стабильной работы ферментных систем, и как следствие, для нормального протекания всех метаболических процессов в условиях низких температур.
Район сбора проб – Конгсфьорд, о. Западный Шпицберген
Сбор молоди и взрослых особей люмпена пятнистого проводили в январе 2014 года (полярная ночь) в акватории острова Западный Шпицберген архипелага Шпицберген, в заливе Конгсфьорд (рисунок 4, 5) в ходе экспедиции «Marine Night field campaign 2014» на научном судне «Helmer Hanssen» (The Arctic University of Norway (UiT), Troms).
Экспедиция была организована в рамках международного проекта «Timing of ecological processes in Spitsbergen fjords» (SpitsEco) (2014–2016 гг), направленного на изучение трофических взаимодействий между доминирующими видами планктона и ключевым видом рыбы – люмпеном пятнистым в акватории арх. Шпицберген. Данный проект тесно взаимосвязан с другими крупными международными проектами «Circa» и «Cleopatra II», целью которых было исследование биологических процессов в арктических экосистемах и взаимодействия преобладающих видов макрозоопланктона с окружающей средой.
Сбор материала проводили в Конгсфьорде, в одной из крайних точек ареала обитания люмпена пятнистого (78057 c.ш. 11056 в.д.) (рисунок 4). Видовую принадлежность выловленных рыб определяли с использованием данных М.П. Фахей (Fahay, недат.; Mecklenburg, Sheiko, 2004). В траловых уловах помимо молоди люмпена пятнистого встречались также личинки люмпена миноговидного Lumpenus lampretaeformis (Walbaum, 1792) и люмпена среднего Anisarchus medius (Reinhardt, 1837).
Конгсфьорд – открытый, широкий (длина – 26 км, ширина - от 4 до 9 км), высокоарктический (79с.ш.) залив (фьорд) первого порядка северо-западного побережья о. Западный Шпицберген (арх. Шпицберген). Для Шпицбергеновских вод характерно наличие в них ряда мощных течений, оказывающих существенное влияние на климат и ледовую обстановку в районе архипелага (Анциферова и др., 2014). Конгсфьорд находится, главным образом, под влиянием холодных (температура 0C) и опресненных «арктических вод» (за счет таяния прибрежных льда и ледников, в его основании ледники Кронебрин и Конгсвеген, осадков). «Арктические воды» (с температурой 0C и соленостью до 34,8) двигаются в поверхностных слоях вод Конгсфьорда, и в котловинах с температурой 1C и соленостью 34,4 (Svendsen et al., 2002).
В то же время для Конгсфьорда характерно вторжение теплых (4C) и соленых Атлантических вод Западного Шпицбергеновского течения, влияние которого усиливается с началом полярного дня. В результате во фьорде образуются смешанные воды («Трансформированные Атлантические воды») с температурой 1C и соленостью 34,7, доминирующие в летний период.
Конгсфьорд является хорошей моделью для изучения функционирования арктических экосистем и жизнедеятельности отдельных его представителей под влиянием климатических изменений (Svendsen et al., 2002; Hop et al., 2002, 2006; Huenerlage, Buchholz, 2015). В связи с глобальным потеплением произошло усиление влияния Западно-Шпицбергеновского течения, что отразилось на сроках ледостава и площади ледового покрова Конгсфьорда. Так, в последнее десятилетие Конгсфьорд практически не покрывается льдом в период полярной ночи (Cottier, 2005; Willis et al., 2006, 2008). По данным ГМО Баренцбург в зимний сезон 2013–2014 гг. ледовые условия в районе арх. Шпицберген проходили по типу малоледных. Результаты изучения изменения климата на архипелаге Шпицберген указывают на продолжающееся потепление (Семенов и др., 2002). Кроме того, в фауне фьорда повышается количество таких атлантических видов зоопланктона как C. finmarchicus, Themisto abyssorum, а также Oithona similis and Pseudocalanus (Hop et al., 2006), что оказывает влияние на трофические взаимодействия гидробионтов.
Для вылова молоди и взрослых особей люмпена в шельфовой зоне Конгсфьорда использовали следующее оборудование: сеть «MIK» для вылова личинок люмпена стадии развития L1 (эпипелагиаль – глубина 30 м), пелагический трал для вылова молоди люмпена в пелагиали (глубина 125 м) и донный трал для вылова молоди люмпена переходных стадий развития L4, L4 , а также ювенильной стадии развития L5 и взрослых особей, обитающих у дна.
Гидродинамические параметры сбора материала, оборудование и количество проб, используемых для анализа, представлены в таблице 1.
В связи с отсутствием данных о росте люмпена пятнистого в Конгсфьорде в зимний период, во время рейса были сделаны морфологические промеры 260 экз. молоди люмпена (с помощью линейки на светлом фоне): абсолютной длины, длины липидного мешка (максимальная длина кольца из меланофоров ограничивающего положение липидного мешка в брюшной части тела личинки люмпена (рисунок 2). Ихтиологические исследования рыб осуществлены по общепринятой методике (Правдин, 1966; Мина, Клевезаль, 1976; Мина и др., 2005).
Статистические параметры, характеризующие изменчивость длины выловленных рыб на разных стадиях личиночного развития, представлены в таблице 2. Показано, что размеры тела молоди люмпена первого года жизни варьируют в диапазоне от 2,4 до 4,2 см. Заметно высокий прирост средней длины тела люмпена отмечен к L2 стадии развития – 2,4 см. Ювенильные особи L5 стадии могут достигать в длину 9, 8 см.
Следует отметить, что вариабельность размеров молоди люмпена была относительно невысока, значения коэффициентов вариации заметно отличались, превышая значения 10%, только у личинок L1 и L4. Липидный мешок формируется у люмпена при переходе личинки на экзогенное питание и имеет на втором году жизни люмпена размеры 1,63 см (таблица 3), что составляет 27,9% общей длины тела рыбы.
Установлено, что для каждой последующей личиночной стадии характерно увеличение размеров липидного мешка, максимальная длина которого для стадии развития люмпена L4 составляет 2,17 см (или 24,3% длины тела). Размеры липидного мешка достоверно не различаются только у личиночных стадий развития L3 и L4.
Вариабельность общей длины тела и размеров липидного мешка для отдельных стадий развития люмпена показывает, что наиболее гетерогенной является возрастная группа люмпена стадии развития L4, где среди рыб выделяются медленнорастущие и быстрорастущие, из которых затем возможно формируется группа особей стадии развития L4 . Рыбы данной стадии развития растут быстро и при этом у них так же динамично увеличиваются размеры липидного мешка (рисунок 7). Показаны достоверные различия по длине тела и липидного мешка у личинок люмпена стадий развития L4 и L4 .
Жирнокислотный спектр общих липидов мышц молоди люмпена пятнистого (стадии развития L1–L5)
В жирнокислотном спектре общих липидов мышц молоди люмпена пятнистого идентифицировано около 40 жирных кислот (ЖК) различной структуры. Установлено повышение содержания мононенасыщенных жирных кислот (МНЖК) в процессе развития люмпена пятнистого от личинки до ювенильной особи в 2,5 раза (от 26,0 до 53,1% суммы ЖК) (рисунок 10). При этом показана динамика снижения уровня полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в процессе личиночного развития люмпена (от 45,0 до 30,7% суммы ЖК). Установлено понижение содержания насыщенных жирных кислот (НЖК) от L1 к L5 стадии (от 29,39 до 16,09 % суммы ЖК).
В группе ПНЖК в мышцах молоди люмпена доминировали жирные кислоты n-3 семейства (до 39,1% суммы ЖК) по сравнению с содержанием ПНЖК n-4 (до 6,9% суммы ЖК) и n-6 семейств (до 4,1% суммы ЖК). При этом уровень n-3 ПНЖК наиболее высок на ранних стадиях развития люмпена (L1– L3) – 34,4–39,1%, и понижается с возрастом рыбы (23,8–25,3% суммы ЖК) (рисунок 11).
Среди ПНЖК n-3 семейства преобладали длинноцепочечные высоконенасыщенные жирные кислоты – эйкозапентаеновая (ЭПК) – 20:5(n-3) и докозагексаеновая (ДГК) – 22:6(n-3) кислоты (рисунок 12). Более высокая (p0,05) концентрация ЭПК и ДГК (12,56% и 24,04% соответственно) отмечена в мышцах люмпена на L1 стадии развития, а у молоди старшего возраста она понижается (до 7,07% и 9,81% соответсвенно). Следует отметить, что на L1 стадии развития люмпена содержание ДГК выше содержания ЭПК в 2 раза. Установлено повышение содержания октадекатетраеновой кислоты 18:4(n-3) ЖК (от 0,7 до 4,3% суммы ЖК) у молоди люмпена, обитающей в придонных слоях воды (L4, L4 , L5 стадии развития) (рисунок 12).
Установлена сходная динамика понижения уровня ЭПК и ДГК в мышцах от L1 к L5 стадии развития (рисунок 13).
В мышцах молоди люмпена L1–L3 стадий развития установлен высокий показатель соотношения суммы n-3 ПНЖК/n-6 ПНЖК – 10, который понижается (p0,05) до 7 у молоди старшего возраста.
Среди ПНЖК n-6 семейства в мышцах молоди люмпена стадий развития L1–L5 наибольшее содержание отмечено для линолевой 18:2(n-6) (1,16–1,78% суммы ЖК) и арахидоновой 20:4(n-6) ЖК (0,32–1,32% суммы ЖК). Уровень арахидоновой кислоты 20:4(n-6) достоверно выше у молоди люмпена на L1 стадии развития (1,32% суммы ЖК) по сравнению с другими стадиями развития (0,3–0,8% суммы ЖК) (рисунок 14).
В группе мононенасыщенных жирных кислот (МНЖК) в мышцах молоди люмпена доминируют эйкозеновая 20:1(n-9) и докозеновая 22:1(n-11) ЖК, а также гексадеценовая (пальмитолеиновая) 16:1(n-7), октадеценовая (олеиновая) 18:1(n-9), уровень которых изменяется в процессе раннего постэмбрионального развития люмпена (рисунок 14).
Установлено, что содержание олеиновой кислоты 18:1(n-9) (11,88% суммы ЖК) на стадии развития L1 выше (p0,05), чем у молоди люмпена старшего возраста (рисунок 14) (5,9–7,5% суммы ЖК). Уровень 20:1(n-9) и 22:1(n-11) ЖК в мышцах люмпена значительно повышается (p0,05) к L2 стадии развития (от 3,6 до 13,2 и от 3,3 до 11,9% суммы ЖК соответственно). Наиболее высокое содержание этих кислот обнаружено у молоди люмпена L4 и L5 стадий развития, и составляет до 20,5 и 16,9% суммы ЖК соответственно. Показана динамика повышения содержания (от 2,88 до 5,22% суммы ЖК) пальмитолеиновой 16:1(n-7) ЖК от L1 к L5 стадии развития люмпена пятнистого (рисунок 14).
Среди насыщенных жирных кислот у молоди люмпена в количественном соотношении преобладает гексадекановая (пальмитиновая) 16:0 ЖК, при этом ее уровень понижается от L1 к L5 стадии развития (от 17,6 до 9,0% суммы ЖК) (таблица 5). Достоверно более высокое содержание октадекановой (стеариновой) 18:0 ЖК отмечено в мышцах L1 стадии люмпена (6,5% суммы ЖК) по сравнению с другими стадиями (1,8–2,4% суммы ЖК).
Значения представлены в виде M±m (среднее арифметическое±стандартная ошибка среднего значения). Обозначения: НЖК – насыщенные жирные кислоты, n – число проб. Различия достоверны (p0,05): a – от L1 стадии развития; b – от L2 стадии развития; c – от L3 стадии развития; d – от L4 стадии развития
Проведен дискриминантный анализ ЖК состава мышц молоди люмпена пятнистого, который позволил с 95% точностью разделить разновозрастную молодь люмпена на группировки по изменчивости содержания совокупности ЖК (14:0, 16:0, 18:0, 16:1(n-7), 18:1(n-9), 20:1(n-9), 22:1(n-11), 18:2(n-6), 20:4(n-6), 18:3(n-3), 20:5(n-3), 22:5(n-3), 22:6(n-3)), играющих важную роль в процессах липидного обмена рыб (рисунок 15).
Первая каноническая ось или главная компонента определяет 57% общей изменчивости показателей (=0,0002; p=0,0000) и сформирована 22:5(n-3), 20:5(n-3) и 14:0 кислотами. Вторая каноническая ось (или вторая компонента) -35% общей изменчивости (=0,02; p=0,0000) и сформирована 22:6(n-3), 22:1(n-11), 18:0 ЖК. В пространстве этих осей четко выделяется группировка личинок (L1 стадия развития), пелагическая молодь (L2, L3 стадий развития) и молодь люмпена старших возрастов (L4, L4 и L5 стадий развития), которая начала переходить или ведет придонный образ жизни.
Жирнокислотный спектр фосфолипидов и триацилглицеринов липидного мешка молоди люмпена пятнистого на стадиях развития L3, L4, L4
В ЖК спектре фосфолипидов (ФЛ) и триацилглицеринов (ТАГ) липидного мешка, как и мышц, молоди люмпена пятнистого идентифицировано более 35 ЖК различной структуры.
Установлено, что в липидном мешке содержание НЖК и ПНЖК достоверно выше в составе ФЛ, а МНЖК в составе ТАГ на исследуемых стадиях развития – L3, L4, L4 (таблица 13,14), как отмечено и в мышцах.
Установлено сходное соотношение в содержании групп жирных кислот в ТАГ липидного мешка и мышц молоди люмпена пятнистого на стадиях развития L3, L4, L4 : значительно преобладают МНЖК, в меньшем количестве представлены НЖК и ПНЖК, при этом содержание НЖК выше (рисунок 25).
В ЖК спектре ФЛ липидного мешка в процессе развития молоди люмпена отмечаются следующие вариации: понижение (p0,05) НЖК (от 58,1 до 25,9% суммы ЖК) и повышение (p0,05) содержания МНЖК (от 26,3 до 60,6% суммы ЖК) к стадии развития L4 .
Жирнокислотный состав ТАГ характеризуется стабильностью – достоверные различия по содержанию групп ЖК на всех исследуемых стадиях развития молоди люмпена отсутствуют (таблица 15).
Среди МНЖК в ТАГ доминировали эйкозеновая 20:1(n-9) (27,5–28,2% суммы ЖК) и докозеновая 22:1(n-11) (26,9–29,3% суммы ЖК) ЖК. Достоверных различий в содержании отдельных МНЖК между стадиями не обнаружено.
Среди МНЖК в ФЛ также преобладали в количественном отношении эйкозеновая 20:1(n-9) и докозеновая 22:1(n-11) ЖК, однако их уровень значительно ниже по сравнению с таковым в ТАГ (таблица 15, 16). Уровень эйкозеновой 20:1(n-9) и докозеновой 22:1(n-11) ЖК в ФЛ возрастает (p0,05) к L4 стадии развития от 9,7 до 24,8% суммы ЖК и от 7,7 до 20,4% суммы ЖК соответсвенно.
Следует отметить, что содержание пальмитолеиновой 16:1(n-7) ЖК выше в составе ТАГ (6,2–7,1% суммы ЖК) по сравнению с ФЛ (2,0–5,0% суммы ЖК).
Среди ПНЖК в липидном мешке молоди люмпена пятнистого стадий развития L3, L4, L4 преобладают ЖК n-3 семейства как в ФЛ (4,6–7,7% суммы ЖК), так и в ТАГ (4,8–5,8% суммы ЖК) (таблица 15, 16). Среди ПНЖК n-3 семейства в ФЛ в большем количестве содержаться длинноцепочечные эйкозапентаеновая 20:5(n-3) (0,5–1,5% суммы ЖК) и докозагексаеновая 22:6(n-3) жирные кислоты (2,0–4,6% суммы ЖК). В составе ТАГ – 20:5(n-3) (0,7–1,0% суммы ЖК) и 22:6(n-3) ЖК (1,3–1,6% суммы ЖК), а также 18:4(n-3) ЖК – 1,7– 2,0% суммы ЖК. Содержание других ЖК в ФЛ и в ТАГ составляет меньше 1% суммы ЖК.