Введение к работе
Актуальность проблемы. Срєли всего многообразия дитохром Р-450-содеРжаших монооксигеназных систем (АРчаков, 1983; ArchaKov. Bachmanova. 1990) особо можно выделить микросомальную монооксигеназнуго систему печени, стоящую в эволюционном аспекте на самой высокой ступени Развития. Не вызывает сомнений Функциональная значимость системы, как в процессах детоксикации чужеродных соединений, так и в биосинтетических процессах, протекающих в печени. Поэтому, принципиально важным для понимания основных принципов Регуляции микросомальной монооксигеназы является изучение механизмов белок-белковых взаимодействий, организации каталитически активных комплексов между ее компонентами.
В последнее время для решения этой проблемы широкое использование получили сшивающие реагенты. С помощью водорастворимого кар-бодиимида получены, выделены и охарактеризованы ковалентно сшитые в ФосФолипидных визикулах гєтєродимєрн HADPH-ФП с иитохромами Ь5 и с (НаиК, НаиК. 1989; Nisimoto. 1986; Nlsiraoto, OtsuKa-Huracami, 1988), между иитохромами Ь5 и Р-450 (Nisimoto, OtsuKa-Huracami, 1988, Tamburini, SchenKman, 1987), иитохромами Ь5 и с (НаиК. НаиК, 1989, Nisimoto, OtsuKa-Huracami, 1988). Зафиксировать образование комплекса NADPH-ФП с цитохромом Р-450 LH2 со стехиометрией Ферментов 1:1 удалось в присутствии ФосФолипидов после обработ ки белок-ФосФолипидной смеси сшивающим Реагентом, однако содержание комплекса составляло не более 10. что не позволило выделить его и охарактеризовать (Bernhardt et al. , 1984; Tamburini et al., 1986). В то же врємя Nisimoto, OtsuKa-Huracami (1988); SchenKman
et al., (1991) не удалось выявить образование ковалентного комплекса HADPH-ФП и цитохрома Р-450 при обработке белков карбодиимидом в присутствии ФосФолипидов.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось выяснение молекулярных механизмов взаимодействия цитохрома Р-450 LH2 и HADPH-ФП с использованием сшивающих реагентов и кинетических параметров реакции Ы-деметилирования бензФетамина в НРС.
В процессе исследования решались следующие конкретные задачи:
-
Выяснение возможности получения бинарного комплекса цитохрома Р-450 LH2 и HADPH-ФП в различных реконструированных системах и агрегатных состоянияхс использованием сшивающих реагентов (ЭЖ, ДНА, дно.
-
Исследование влияния ионной силы среды на скорость окисления бензФетамина в MFC
-
СпектроФотометрическое исследование взаимодействия цитохрома Р-450 LH2 И HADPH-ФП В НРС.
-
Исследование кинетических параметров взаимодействия цитохрома Р-450 LH2 и HADPH-ФП в реакциях HADPH-зависимого Н-деметилирова -ния бензФетамина в нрс.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В результате проведенных исследований показано, что цитохром Р-450 LM2 и HADPH-ФП в различных реконструированных системах и агрегатных состояниях не образуют эквимолярных комплексов после обработки их сшивающими реагентами ЭДК, ДНА, дне. Образование комплекса белков в НРС не было зарегистрировано и спектрофотомет-рически. В тоже время установлено, что с увеличением ионной силы среды наблюдается снижение скорости окисления бензФетамина. что указывает на определенную роль электростатических сил во взаимо -
действии HADPH-ФП И LM2.
Рассчитана константа диссоциации комплекса гемо- и Флавопротеинов из кинетических характеристик реакций NADFH-зависимого N-деметилирования бензФетамина в MFC, составляющая 1, 5+0,5 мкм.
Обнаружено Формирование эквимолярных комплексов цитохрома Ь5 -NADFH-ФП и цитохромов Р-450 LM2-b5 при обработке белков эдк в МРС и рассчитана из спектров связывания константа диссоциации комплекса цитохромов Р-450 LH2-b5, составляющая 1,2±0, 5'мкМ.
Апробация диссертации. Результаты исследований были доложены на конференции молодых ученых НИИ Физико-химической медицины (Москва, 1989), Всесоюзной конференции "НИТОХРОМ Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1989), а также на совместном заседании учебно-научного комплекса каФедры биохимиии МВФ 2-го МОЛГМИ им. Н. И. пирогова и института биологической и медицинской химии АМН СССР (26 июня 1991).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.
структура и объем работы, диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста, включая 21 рисунок и 14 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, глав, содержащих описание материалов и методов исследования, экспериментальной части с результатами исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.