Содержание к диссертации
Введение
1 Введение 4
1.1. Актуальность темы 4
1.2. Научная новизна 6
1.3. Теоретическая и практическая значимость работы 7
1.4. Положения, выносимые на защиту 7
1.5. Апробация работы 7
1.6. Публикации 8
1.7. Личный вклад соискателя 8
1.8. Структура и объем диссертации 8
2 Обзор литературы 9
2.1. Влияние стресса на биохимические и физиологические показатели организма млекопитающих 9
2.2. Методы изучения индивидуально-типологических характеристик животных 14
2.3. Роль эмоциогенных структур головного мозга млекопитающих при различных стрессовых воздействиях 18
2.4. Роль коэнзима Q10 в поддержании гомеостаза организма млекопитающих 22
2.5. Омиксные технологии: нутрипротеомные исследования 26
3 Экспериментальная часть 34
3.1. Материалы и методы исследования 34
3.1.1. Методы физиологических исследований 35
3.1.2. Методы биохимических исследований 36
3.1.4. Методы протеомных исследований 38
3.2. Результаты собственных исследований 43
3.2.1. Сравнительный анализ состояния органов-маркеров стресса 43
3.2.2. Исследование динамики изменений концентрации глюкозы в крови крыс 49
3.2.3. Исследование динамики содержания CoQ10 в сыворотке, печени и мозге крыс 52
3.2.4. Исследование цитокинового профиля сыворотки периферической крови крыс 58
3.2.5. Исследование активности катепсинов D и B в печени и мозге крыс 69
3.2.6. Протеомное исследование сыворотки крови крыс 73
3.2.7. Протеомное исследование головного мозга крыс
3.2.7.1. Миндалина 75
3.2.7.2. Кора 79
3.2.7.3. Гиппокамп 85
3.2.7.4. Ретикулярная формация
4 Обсуждение 96
5 Выводы 109
6 Список сокращений 111
7 Список источников
- Теоретическая и практическая значимость работы
- Методы изучения индивидуально-типологических характеристик животных
- Роль коэнзима Q10 в поддержании гомеостаза организма млекопитающих
- Исследование динамики содержания CoQ10 в сыворотке, печени и мозге крыс
Теоретическая и практическая значимость работы
Метаболические аспекты влияния микронутриентов на состояние здоровья являются предметом все более нарастающего числа исследований [99; 108; 243]. На клеточном уровне отдельные нутриенты могут оказывать воздействие на сигнальные пути [131], непосредственно могут выступать как лиганды рецепторов фактора транскрипции [181], при обменных процессах в качестве межуточных метаболитов могут изменять концентрацию субстратов и промежуточных продуктов [188]. Различные факторы, прямо или косвенно способные влиять на характер питания человека, оказывают воздействие на поддержание целостности организма, и, в частности, могут приводить к нарушениям системной организации физиологических функций и развитию заболеваний различных систем: гормональной, иммунной, репродуктивной и др. Так, стрессовые состояния приводят к изменениям многих показателей, характеризующих функциональный статус организма на различных структурных уровнях [153]. Адаптивные состояния, вызванные стрессом, хоть и необходимы для выживания, однако могут приводить к дисрегуляции системных функций и, как следствие, болезни [163]. В настоящее время доказано, что стрессорные нагрузки сопровождаются изменением метаболизма глюкозы, снижением чувствительности тканей к инсулину и, таким образом, развитием сахарного диабета [15]. Множественные изменения происходят под действием стресса в нервной системе: на уровне нервной цепочки стресс может привести к структурному ремоделированию или молекулярным реорганизациям, таким как увеличение количества или потеря дендритных шипиков, нейрональной атрофии, изменению экспрессии многих синаптических белков (например, глутаматных рецепторов) [327]. В частности, при пищевой депривации наблюдается расширение функциональных зон коркового вещества головного мозга; энергетический баланс в указанных условиях поддерживается за счет снижения в крови уровня тиреоидных и половых гормонов, что сопровождается экспрессией регуляторных пептидов в гипоталамусе [237].
В качестве центрального органа стресса и адаптации к стрессорным факторам мозг играет ключевую роль в формировании поведенческих и физиологических реакций, которые могут привести к успешной адаптации или развитию психических и соматических заболеваний [211]. И особая роль в этом отводится лимбической системе – комплексу структур мозга, участвующих в организации эмоционально-мотивационного поведения, а также инстинктов, пищевого, полового и оборонительного поведения, смене фаз сна и бодрствования. Наиболее полифункциональными образованиями лимбической системы, включающимися в ответную реакцию на стресс, являются миндалина, гиппокамп и ретикулярная формация головного мозга [14; 195; 273]. Важную роль в поддержании рабочей памяти, исполнительных функций и саморегуляции поведения играет префронтальная кора [212]. В многочисленных экспериментах было показано, что хронический стресс вызывает структурное ремоделирование нейронов медиальной префронтальной зоны коры головного мозга, обратимое у молодых животных после прекращения хронического стресса, менее обратимое у животных среднего возраста и в еще меньшей степени у старых животных [213]. Хронический стресс, а также физические и эмоциональные нагрузки приводят к увеличению потребления эндогенного коэнзима Q10, одного из важнейших участников сопряжения электронного транспорта и окислительного фосфорилирования, выполняющего также антиоксидантную функцию, обусловливая высокую вероятность развития его дефицита [41]. Развитие же многих обменных и иммунных заболеваний и преждевременного старения тесно связано с недостатком энергообразования в организме и повреждением клеточных генераторов энергии [112]. Многие патологические состояния у млекопитающих развиваются не во время, а после окончания действия стрессогенного фактора. И именно постстрессорный период является критическим в плане разворачивания всего комплекса компенсаторных реакций, направленных на ограничение отрицательных последствий экстремального воздействия [101]. Существенно, что характер протекания восстановительного периода после стрессорной нагрузки отличается у особей с разными параметрами поведения, характеризующихся различной чувствительностью к стрессу [35]. Поэтому в плане предупреждения или снижения выраженности постстрессорной патологии важен индивидуальный подход к анализу механизмов предрасположенности или устойчивости организма к влиянию экстремальных внешних факторов.
Для реализации этих целей требуются технологии повсеместно называемые «Омиками», основанные на высокопроизводительных методах анализа и способные анализировать все возрастающей объем биологической информации. С учетом новейших достижений в области молекулярной медицины, актуальным в этом плане представляется поиск новых протеомных маркеров формирования и реализации адаптационно-компенсаторных реакций организма на разных стадиях после стрессорной нагрузки, а также разработки новых путей коррекции нарушений физиологических функций с помощью биологически активных веществ природного происхождения [282; 325].
Работа выполнена в соответствии с планом НИР ФГБУН «ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи» в рамках темы №127 «Исследование роли биологически активных веществ природного происхождения в механизмах формирования устойчивости функций к воздействию экстремальных факторов окружающей среды с идентификацией протеомных маркеров». Целью настоящей работы явилось экспериментальное исследование влияния коэнзима Q10 на биохимические процессы, определяющие адаптацию организма в условиях метаболического стресса, с идентификацией протеомных маркеров.
Основные задачи исследования:
1. Исследовать особенности биохимических показателей сыворотки крови (содержание глюкозы, коэнзима Q10, уровень про- и противовоспалительных цитокинов), печени (содержание коэнзима Q10, активность катепсинов В и D) и головного мозга (содержание коэнзима Q10, активность катепсинов В и D) крыс с различной поведенческой активностью в условиях метаболического стресса.
2. Изучить протеомные профили сыворотки крови и эмоциогенных структур головного мозга (гиппокампа, ретикулярной формации, миндалины и сенсомоторной коры) поведенчески активных и пассивных крыс в условиях метаболического стресса.
3. Оценить влияние коэнзима Q10 на биохимические показатели сыворотки крови (содержание глюкозы, коэнзима Q10, уровень про- и противовоспалительных цитокинов), печени (содержание коэнзима Q10, активность катепсинов В и D) и головного мозга (содержание коэнзима Q10, активность катепсинов В и D) крыс с различной поведенческой активностью в условиях метаболического стресса при введении его в состав рациона.
4. Оценить роль коэнзима Q10 в изменении протеомных профилей сыворотки крови и эмоциогенных структур головного мозга (гиппокампа, ретикулярной формации, миндалины и сенсомоторной коры) поведенчески активных и пассивных крыс в условиях метаболического стресса при введении его в состав рациона.
5. Идентифицировать белки, дифференциально экспрессирующиеся в условиях метаболического стресса и при включении в рацион коэнзима Q10, методом масс-спектрометрического анализа.
6. Выявить взаимосвязь между изменениями биохимических показателей сыворотки крови исследуемых тканей и органов и особенностями протеомных профилей сыворотки крови и эмоциогенных структур головного мозга крыс с различной поведенческой активностью в условиях метаболического стресса и при включении в рацион коэнзима Q10.
Методы изучения индивидуально-типологических характеристик животных
Таким образом, один и тот же стрессорный фактор может приводить к возникновению и развитию разных ответных реакций у животных одной популяции [5; 88]. И если не проводить предварительное разделение подопытных животных с учетом их индивидуальных различий, то полученный в ходе эксперимента усредненный результат приведет к отсутствию достоверного эффекта. Еще в 70-е гг. XX в. Вальдман А.В. с соавт. в своих работах подчеркивали важность «моделирования стресса с учетом типологической характеристики животных» [13]. В связи с этим в современных медико-биологических исследованиях все большее внимание уделяется оценке индивидуально-типологических характеристик экспериментальных животных. Альтернативой данному подходу является использование инбредных и нокаутных линий животных, однако в силу причин технического (отсутствие нужных линий) или экономического (высокая стоимость) характера вэто не всегда возможно. Поэтому типирование животных по характеру их поведенческих реакций продолжает оставаться эффективным и привлекательным подходом при изучении стресса.
Для оценки связи типологических особенностей поведения животных и устойчивостью их организма к действию стрессорных факторов используются поведенческие тесты, которые позволяют оценить наиболее информативные поведенческие характеристики животных: их эмоциональный статус, двигательную и поисковую активности [48]. Оправданным показал себя экспериментальный подход, основанный на изначальном разделении животных (в частности, крыс) в зависимости от показателей их поведения в тесте «открытое поле» (ОП). В данном тесте животное помещают в незнакомое открытое пространство, часто с ярким освещением, из которого оно не может выбраться [47]. Незнакомая среда запускает сложный набор поведенческих реакций, отражающих тревожность и стремление исследовать новую территорию. Текущее поведение животного в ОП определяется, таким образом, соотношением оборонительных и исследовательских тенденций. Яркое освещение при этом является для крыс дополнительным стрессорным фактором. При тестировании регистрируют двигательную активность животных (горизонтальную и вертикальную), груминг, исследование объектов (отверстий или столбиков), дефекацию и уринацию. Также возможна оценка отклонений в моторной деятельности: шаткость походки, тремор и др. Длительность проведения теста можно варьировать в зависимости от целей конкретного эксперимента. При этом стоит учитывать, что в первые 3-5 минут поведение животного связано с воздействием сильных эмоциогенных факторов (внезапность, необычность и новизна), а в дальнейшем наблюдается поведение патрулирования, внешне очень похожее на первоначальное, но имеющее в основе другие нейрохимические механизмы [58]. На основании результатов тестирования крыс делят на группы поведенчески активных и пассивных особей [35]. Согласно результатам исследований, проведенных в НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, крысы с высокой поведенческой активностью в данном тесте оказались прогностически более устойчивы к воздействию стрессорных факторов [58].
Приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) и тест «темно-светлая камера» являются другими популярными тестами для изучения поведения животных в условиях переменной стрессогенности, т.е. при свободном выборе комфортных условий, и позволяют оценить их уровень тревожности. ПКЛ представляет собой установку, имеющую два рукава, в месте пересечения которых находится открытая площадка. Оценка поведения в данном тесте основана на естественном стремлении животного оставаться в закрытых (темных) местах и природном страхе к открытым пространствам и высотам [40]. При этом регистрируют число заходов и время пребывания в закрытых и открытых рукавах, латентный период захода в открытый рукав, количество стоек, число заглядываний под лабиринт, дефекаций и др. «Темно-светлая камера» позволяет оценить предпочтение животным темноты или света, выраженность и динамику поведения «выглядывание», привыкание. Представляет собой два смежных закрытых отсека: темный и ярко освещенный, соединенные четырехугольным отверстием. При проведении теста регистрируют число заходов и продолжительность пребывания в темном и светлом отсеках, латентный период выхода в темный отсек, число выглядываний, стоек, груминга [69].
В зарубежных исследованиях [139; 239; 281] широкое распространение получил тест на гипонеофагию (ТГНФ), основанный на угнетении пищевого поведения в ответ на новизну среды [81]. В данном тесте оцениваются латентный период взятия в лапы корма и количество съеденной пищи. Помещение животного в новую обстановку является стрессорным фактором, и мыши и крысы изначально будут проявлять осторожность к новой для них пище, поскольку у грызунов отсутствует рвотный рефлекс, и в результате повышается риск отравления [139]. Соответственно, сокращение потребления пищи может использоваться в качестве меры оценки стресса.
Общепризнанным для оценки депрессивного поведения грызунов является тест «принудительное плавание» (тест Порсола), когда особь помещают в цилиндрическую емкость с водой, откуда невозможно выбраться. При проведении теста оценивается время смены трех состояний животного: иммобилизации, активного и пассивного плавания [32]. Состояние неподвижности (зависания) ассоциируется с поведением отчаяния или так называемым «состоянием потери животным надежды - безысходностью» [3]. Тест «принудительного плавания» широко используется с целью определения изначального уровня тревожности у лабораторных грызунов, их эмоционального поведения (склонность к депрессии), а также для выявления адаптогенной эффективности различных групп препаратов природного и синтетического происхождения [3; 29].
Приведенные данные показывают, что различия индивидуальной устойчивости млекопитающих к отрицательным эмоциогенным воздействиям проявляются, в частности, в особенностях формирования стрессорного ответа организма. Это находит отражение в специфике адаптационно-компенсаторных процессов на всех уровнях организации – от субклеточного до органного. Современные поведенческие тесты позволяют получить полную информацию о наиболее важных типологических особенностях животных для исследованияй в области психофизиологии (изучение действия стресса на организм), психофармакологии (оценка действия лекарственных средств), нейробиологии (локомоторная стреотипия) и нейрогенетики (поведенческое фенотипирование разных линий). А комбинированное использование различных методов оценки поведения особей способно повысить степень верифицируемости и достоверности результатов.
Роль коэнзима Q10 в поддержании гомеостаза организма млекопитающих
Концентрацию глюкозы в крови определяли с помощью глюкометра (Contour TS, Bayer). Достоверность межгрупповых различий выявляли с помощью непараметрического критерия Mann-Whitney (Statistica 6.0).
Для получения сыворотки крови собранную кровь отстаивали в течение 60 минут при комнатной температуре и центрифугировали в течение 15 мин при 1500g. Полученные пробы сыворотки крови хранили в низкотемпературной камере при температуре -70С. Хроматографическое определение CоQ10 в сыворотке крови, печени и мозге осуществляли при помощи ВЭЖХ системы Agilent 1100 (США) со спектрофотометрическим детектором. Образцы печени и мозга готовили путем их гомогенизации в буфере (0,154 М KCL, 5 мМ Tris-HCl, pH 7,4) в конечном соотношении 1:4 (m:V) в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейема с тефлоновым пестиком (зазор 0,2 мм) с использованием погружной верхнеприводной лопастной мешалки RW 20 digital (IKA, Германия). Полученные гомогенаты центрифугировали в течение 15 мин при 5000 g. К 200 мкл надосадочной жидкости добавляли 20 мл бутилгидрокситолуола (BHT) в качестве антиоксиданта и 800 мкл изопропилового спирта, после чего смесь центрифугировали 3 мин при 1000g. Разделение осуществляли при помощи ВЭЖХ системы Agilent 1100 со спектрофотометрическим детектором (Agilent Technologies, США) на аналитической колонке Luna C18 150х4,6 (Phenomenex, США) в изократическом режиме элюирования (подвижная фаза: изопропиловый спирт – ацетонитрил (3:2), скорость потока 1 мл/мин). Детектирование проводили при 275 нм.
Активность катепсинов В и D определяли в гомогенатах печени и мозга. Образцы готовили путем их гомогенизации в буфере (0,32 М сахароза, 10 мМ Tris-HCl, pH 7,5) в конечном соотношении 1:3 (m:V) в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейема с тефлоновым пестиком (зазор 0,2 мм) с использованием погружной верхнеприводной лопастной мешалки RW 20 digital (IKA, Германия). Полученные гомогенаты центрифугировали в течение 15 мин при 5000 g.
Активность катепсина D определяли инкубацией гомогенатов с гемоглобином в качестве субстрата ферментолиза, с целью повышения специфичности оценки применяли ингибиторный анализ с использованием пепстатина А. После 5 минут инкубации (для печени) и 30 минут инкубации (для мозга) измеряли оптическую плотность ТХУ растворимых продуктов, образующихся в результате протеолиза гемоглобина, при 280 нм на спектрофотометре Cary 100 Bio (Agilent Technologies, США) [107]. Активность фермента выражали в мкМ тирозина, высвободившегося в результате расщепления гемоглобина на 1 мг белка за полное время инкубации.
Активность катепсина B определяли флуориметрическим методом [106]. В качестве субстрата использовали Na-CBZ-Arg-Arg-7-амидо-4-метилкумарин (Arg-Arg-7-AMC). После инкубации гомогенатов в течение 5 минут (для печени) 30 минут (для мозга) измеряли флуоресценцию образующегося 7-амидо-4-метилкумарина (АМС) при 440 нм (возбуждение при 348 нм) на флуоресцентном спектрофотометре Cary Eclipse (Agilent Technologies, США). Активность катепсина В выражали в мкМ амидометилкумарина, высвобождаемого из Arg-Arg-7-AMC на 1 мг белка за полное время инкубации. Определение цитокинового профиля сыворотки периферической крови крыс проводили методом мультиплексного анализа на установке Bio-Plex («Bio-Rad», США). В исследовании использовали наборы реагентов для анализа цитокинов (Bio-PlexPro RatCytokine Thl/Th2 Assay, кат. № 171-К1002M). Измеряли содержание провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-і, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12р70, ИЛ-13, ИФН-, ГМ-КСФ)1. Сыворотку крови для мультиплексного анализа готовили в соответствии с руководством к набору реагентов для анализа цитокинов Bio-PlexPro Assays («Bio-Rad», США).
Собранную после декапитации крыс кровь для мультиплексного иммунного анализа помещали в пробирки с сывороточным разделителем (набор сывороточных разжижителей Bio-Plex), отстаивали в течение 30 минут, а затем центрифугировали со скоростью 3000 об/мин в течение 10 минут при температуре +4С (Мульти центрифуга СМ-6М, ELMI, Латвия). Полученные пробы сыворотки крови замораживали в жидком азоте и хранили в низкотемпературной камере при температуре -70С.
После полного размораживания пробы сыворотки крови животных готовили к анализу путем разбавления одного объема пробы тремя объемами разжижителя проб сыворотки крысы Bio-Plex 171-К1002М (1x96). После фильтрации на предварительно увлажненную пластину фильтра добавляли гранулы, и осуществляли двукратную промывку пластины. На пластину помещали пробы сыворотки крови. После 30-минутной инкубации и трехкратной промывки добавляли определяющие антитела к цитокинам (Rat 12-Р1ех A Detection Antibody). Спустя 30 минут инкубации и трехкратной промывки, добавляли стрептавидин-фикоэритрин (входит в состав Bio-Plex Reagent Kit). Все указанные реактивы поставляются в комплекте набора Bio-Plex Rat Cytokine 12-Р1ех A Panel. Ресуспендирование гранул проводили по окончании 10-минутной инкубации и трехкратной фильтрации. Затем пластину помещали в систему Bio-Plex для анализа.
Перед постановкой двумерного электрофореза сыворотку крови очищали от мажорных белков с помощью микрогранул ProteoMiner («Bio-Rad», США).
Далее образцы сыворотки растворяли в буфере для разведения образцов (БРО), содержавшем 7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 5% амфолинов (рН 3-10), 80 мМ ДТТ, 16,7% раствора 30% CHAPS+10% NP40, ингибиторы протеаз (Protease Inhibitor Coctail P8340-1ML;
Определение цитокинового профиля сыворотки периферической крови крыс проводили совместно со с.н.с. Ригером Н.А. и м.н.с. Евстратовой В.С. лаборатории иммунологии ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии». Sigma) в соотношении 100:1 и центрифугировали при 15000 g 15 мин, после чего проводили изоэлектрофокусирование.
К образцам ткани мозга добавляли БРО, содержащий ингибиторы протеаз (Protease Inhibitor Cocktail P8340, Sigma) 100:1, из расчета 150 мкл БРО на 5 мг ткани и помещали в ультразвуковую ванну (УЗВ-12; Сапфир) на 20 мин, а затем центрифугировали при 18500g в течение 20 мин. Далее проводили осаждение белка (1:5) смесью хлороформ:метанол 1:4, после чего снова центрифугировали пробы при 14000g в течение 15 мин. Осадок высушивали при комнатной температуре, трижды промывали водой MilliQ, добавляли 60 мкл БРО и центрифугировали при 14000g в течение 10 мин. Выдерживали образцы 30 мин при комнатной температуре, и далее супернатант использовали для проведения двумерного электрофореза. Концентрацию белка в образцах измеряли по методу Брэдфорда (1976) [117].
Изоэлектрофокусирование проводили в стеклянных 18-сантиметровых трубочках в 4% ПААГ (8 М мочевина, 4% акриламида/метиленбисакриламида, 2% амфолинов рН 3-10, 2% амфолинов рН 3-5, 3% амфолинов рН 5-7, 6% раствора, содержащего 30% CHAPS и 10% NP40, 0,15% TEMED и 0,03% персульфата аммония) с использованием системы PROTEAN IEF Cell («Bio-Rad», США). На трубочки наносили по 50 мкг общего белка для образцов мозга и 25 мкг общего белка для образцов сыворотки. Изоэлектрофокусирование проводили в следующем режиме: 100-200-300-400-500-600 В по 45 мин, 700 В – 11 часов, 900 В – 2 часа. После завершения изоэлектрофокусировки трубочки помещали на 30 мин. в уравновешивающий буфер (6 М мочевина, 20% глицерина, 62,5 мМ Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 20 мМ DTT, бромфеноловый синий следовые количества). Второе направление проводили на 12% ПААГ, в Tris-глициновом буфере при охлаждении в следующем режиме: по 20 мА на стекло – 20 мин, затем по 40 мА на стекло до завершения электрофореза. Полученные гели фиксировали в растворе 10% уксусной кислоты и 20% этанола в течение ночи, после чего проводили окрашивание гелей с использованием нитрата серебра по следующей методике: инкубация в течение 2 мин в 0,03% растворе тиосульфата натрия; инкубация 15 минут в 0,1% растворе нитрата серебра; визуальная проявка раствором 4% натрия углекислого, 0,0006% тиосульфата натрия, 0,0037% формалина; инкубация 15 минут в растворе 10% уксусной кислоты; перед каждой сменой растворов отмывали гели деионизованной водой. Окрашенные гели анализировали с помощью программы PDQuest 8.0 («Bio-Rad», США). Характеристическими считали белковые пятна, повторяемость которых превышала 75%.
Исследование динамики содержания CoQ10 в сыворотке, печени и мозге крыс
В эксперименте без добавки наблюдалось снижение экспрессии НАДН дегидрогеназа [убихинон] железосерного белка 8 у пассивных крыс в группе острого стресса. Железосерный белок 8 является частью т.н. Комплекса 1 мембраны митохондрий, участвующего в передаче электронов с НАДН к дыхательной цепи. Нарушения в работе аппарата синтеза железосерных кластеров могут приводить к развитию клеточного апоптоза, к увеличению количества ионов железа, катализирующих образование активных форм кислорода, и в результате, к сдвигам в процессах митохондриального энергообразования, которые также характерны для процессов старения организма [194]. Введение дополнительного CoQ10 в состав рациона животных в период голода привело к повышению экспрессии железосерного белка 8 у данной группы крыс. Включение в рацион CoQ10 в стадии острого стресса и последующего восстановительного периода приводило к снижению экспрессии характеризуемого белка у обоих поведенческих типов животных.
Острый стресс приводил к повышению экспрессии Ras-связанного белка Rab-14, сохраняющейся и в восстановительный период, у пассивных животных. Данный белок принадлежит к группе низкомолекулярных ГТФ-связывающих белков, относящихся к семейству Ras и регулирующих внутриклеточный транспорт мембранных структур. Кроме того, указанный белок участвует в регуляции межклеточной адгезии и распространении N-кадгерина (CDH2), играющего существенную роль в обучении и памяти [277]. К настоящему времени идентифицировано 24 различных Rab-полипептида, каждый из которых, как предполагается, специфичен для одного определенного вида мембранных структур [115].
В периоды голода и восстановления наблюдалось снижение экспрессии тропомодулина-2 у активных и пассивных особей в результате метаболического стресса. Тропомодулин-2 блокирует концевую элонгацию и деполимеризацию актиновых филаментов [129], что представляет собой основу динамики цитоскелета. Деполимеризация актина эндотелия активирует НАДФН оксидазную систему и приводит к образованию активных форм кислорода в эндотелиальных клетках сосудов, что может приводить к развитию атеросклероза. Тропомодулин специфически связывается с медленно растущим концом актиновых филаментов, подавляя дальнейший рост или диссоциацию филамента на этом конце, и таким образом принимает участие в определении и регуляции длины актиновых филаментов в клетках. Дополнительное введение CoQ10 в рацион всех интактных животных привело к снижению экспрессии тропомодулина-2. У животных групп голода, употреблявших CoQ10, не было выявлено изменений в экспрессии белка по сравнению с экспериментом без добавки. Включение CoQ10 в группы восстановления привело к повышению экспрессии данного белка у активных крыс, в то время как длительный прием добавки не приводил к изменениям экспрессии данного белка.
В эксперименте без добавки у активных крыс наблюдалось повышение экспрессии белка SAR1a в период голода, а у пассивных только на этапе восстановления. ГТФ-связывающий белок SAR1a относится к надсемейству малых ГТФ-связывающих белков и участвует во внутриклеточном транспорте белков [333]. Sar1 белок необходим для сборки белкового комплекса участков экспорта ЭПР, т.н. COPII, формирующего белковую оболочку мембраны везикул [144]. При введении дополнительного CoQ10 в рацион интактных крыс экспрессия белка SAR1a повышалась у животных обеих экспериментальных групп. Включение дополнительного CoQ10 на этапе метаболического стресса в рацион крыс обеих поведенческих групп не влияло на экспрессию SAR1a по сравнению с группами, подвергшихся стрессу без CoQ10. В период восстановления дополнительное включение CoQ10 приводило к снижению экспрессии SAR1a только у пассивных животных.
В эксперименте без добавки в группе голода у активных и группе восстановления у пассивных особей было установлено снижение экспрессии кальцинейрин B гомологичного белка 1. Включение дополнительного CoQ10 приводило к снижению экспрессии идентифицируемого белка у интактных животных обоих поведенческих типов. При этом повышенная экспрессия наблюдалась у активных крыс на этапе стресса, а у пассивных в стадии восстановления. Группы пролонгированного приема CoQ10 характеризовались повышенной экспрессией кальцинейрин В гомологичного белка 1 у животных обоих поведенческих типов. Кальцинейрин B гомологичный белок 1 участвует в везикулярном транспорте во время экзоцитоза, а также слиянии везикул с мембраной [33].
Сниженная экспрессия пероксиредоксина-2 была установлена в эксперименте без добавки у активных и пассивных крыс в период острого стресса. Введение CoQ10 указанной дозировки в рацион крыс привело к повышению экспрессии пероксиредоксина-2 в период голода у всех крыс. Однако дополнительное поступление CoQ10 понизило экспрессию пероксиредоксина-2 у пассивных интактных крыс и крыс группы восстановления. Идентифицированный белок пероксиредоксин-2 является антиоксидантом и осуществляет защиту специфических белков от оксидативных повреждений [201]. Кроме того, он участвует в клеточной пролиферации и дифференциации, внутриклеточной сигнализации, в сигнальных каскадах факторов роста и фактора некроза опухоли альфа, отрицательно регулирует апоптоз, способен повышать активность естественных клеток-киллеров и подавлять репликацию вируса в клетке [178].
В эксперименте без добавки экспрессия белка глутатион S-трансфераза омега-1 у пассивных животных снижалась в период голода по сравнению с контрольными показателями и повышалась в период восстановления, в то время как у активных она продолжала оставаться сниженной. Глутатион S-трансфераза омега-1 помимо участия в катаболизме и детоксикации ксенобиотиков и ряда других функций, играет значительную роль в глутатионовом обмене и защите внутриклеточных белков от необратимого окисления [220]. Т.о. снижение экспрессии глутатион S-трансферазы в период стресса вероятно свидетельствует о нарушении функции защиты белков и других соединений от окисления. Включение CoQ10 в период стресса приводило к повышению экспрессии глутатион S-трансферазы только у пассивных особей. На этапе восстановления дополнительный CoQ10 в рационе животных способствовал повышению экспрессии глутатион S-трансферазы у активных крыс по сравнению с экспериментом без добавки.
Экспрессия белка Tcrb (T-клеточный рецептор бета-цепь) в эксперименте без добавки в период стресса повышалась только у пассивных животных, а в период восстановления наблюдалось снижение экспрессии белка у пассивных и повышение у активных крыс. Данный белок участвует в иммунном распознавании, является основным поверхностным комплексом Т-лимфоцитов, отвечает за распознавание антигенов, связанных с главным комплексом гистосовместимости (МНС) на поверхности антигенпрезентирующих клеток, в частности собственных измененных или погибших клеток [256]. Включение в рацион крыс дополнительного CoQ10 в стрессорный период привело к повышению экспрессии идентифицируемого белка также у активных особей. Введение дополнительного CoQ10 в период восстановления приводило к повышению экспрессии белка у пассивных крыс и снижению у активных.