Введение к работе
\-~-
_.._ АКТУАЛЬНОСТЬ" ПРОБЛЕМЫ В самое последнее время значительно возросло
количество научных работ, прямо или косвенно связанных с оценкой функционального состояния биологических мембран Строгая согласованность работы всех мембранных механизмов - рецепториых, канальных, ферментативных - дает возможность клетке поддерживать свой гомеостаз, сохранять свою целостность и одновременно обеспечивает эффективный и адекватный ответ на возникающие дискомфортные состояния, вызванные изменением работы других систем клетки и организма [А.М.Кобаль и др., 1990].
Многолетними исследованиями было показано, что функциональная активность вне- и внутриклеточных ферментов, биоэнергетика клеток напрямую коррелируют с интенсивностью работы мембранных систем активного транспорта Особое внимание исследователей и в теоретическом, и в прикладном аспектах привлекает работа ионтранспортирующих систем, интегрированных в клеточные мембраны Первенство здесь принадлежит Na'.K'-АТФаэе, изучение функционирования которой представляет самостоятельный интерес. Накоплено большое количество данных о функционировании этого фермента при различной патологии (Swarts et al, 1981, Tosteson, 1981; De luise, Flier, 1982. Canessa, 1984; Постнов, Орлов, 1987, Trevisan et al , 1988; Масюк А И и др , 1989 під) Оценить работу Na'.K'-АТФазы можно, определяя как гидролиз АТФ (определение собственно активности фермента), так и интенсивность транспорта натрия и калия (определение насосной функции).
Исходя из представления о компартментализации пространства внутри самой мембраны, следует предположить, что не вся энергия, высвобождающаяся при гидролизе АТФ этим ферментом, используется для трансмембранного переноса ионов Na* и К.* Поэтому мы попытались оценить его работу вторым из вышеперечисленных способов - по реальной насосной функции, не нарушая целостности клетки и приблизив условия эксперимента к существующим in vivo, использовав в качестве основного метод ионометрии.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Главной целью была оценка ионтранспортирующей функции Ыа*,К*-АТФазы эритроцитов человека при различных физико-химических и биологических параметрах среды инкубации. Для ее достижения были поставлены следующие основные задачи:
изучение возможности применения метода ионометрии для оценки транспорта ионов Na* и К* через мембраны эритроцитов человека,
поиск параметров среды, химических эффекторов, обеспечивающих оптимальные условия для работы Na'.K'-АТФаэы in vitro;
- выяснение вклада каждого из основных транспортных процессов, влияющих
на распределение ионов Na' и К* между внутри- и внеклеточным пространствами.
НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСЬ РАБОТЫ. Впервые для исследований транспортных процессов, в том числе для харе теристики работы системы активного транспорта, успешно применен новый подход с -">льэованием метода
ионометрии. Это позволило вести непрерывную кинетическую регистрацию внеклеточных концентраций ионов Na* и К*, обеспечило сохранение целостности клеток и нативных свойств клеточных мембран в ходе эксперимента, дало возможность максимально приблизить физико-химические и биологические параметры суспензии клеток к условиям, существующим in vivo. Оценка функционирования Na'.K'-АТФазы проводилась не по количеству гидролиэуемых молекул АТФ (приросту неорганического фосфата в среде), а по реальной ионтранспортирующей способности. В работе описаны следующие процессы:
связывание полиенового антибиотика нистатина с мембранами эритроцитов человека;
формирование нистатиновых каналов;
- диффузия ионов Na* и К* по каналам, сформированным антибиотиком
нистатином;
инактивация сформировавшихся нистатиновых каналов,
активный транспорт ионов, обеспечиваемый Ыа\К*-АТФазой. Непосредственное прикладное значение имеет разработка условий эксперимента, при которых имеется возможность проводить сравнительную оценку ионтранспортирующей способности Na'.K'-АТФазы в норме, при патологии и при действии на клетки различных химических агентов и эффекторов, лекарственных препаратов и т.п
1. Предложен новый подход к кинетическим исследованиям процессов
транспорта ионов Na* и К* через мембрану эритроцитов человека с использованием
метода ионометрии.
2. Кинетическое ионометрическое определение концентраций Na' и К* успешно
применено для изучения ионного транспорта через клеточную мембрану, выявлены его
преимущества перед традиционными методами исследования ионтранспортирующих
систем
3. Оптимизированы условия среды, пригодные для оценки работы систем
активного транспорта ионов в эксперименте на цельных клетках.
4. Выявлены основные транспортные процессы, влияющие на формирование
трансмембранного баланса концентраций Na* и К* живых эритроцитов человека при
модификации эритроцитарных мембран полиеновым антибиотиком нистатином,
определен вклад каждого из них в общую кинетическую картину эксперимента.
5. Насосная функция Na'.K'-АТФаэы в эритроцитах человека,
"спровоцированных" нистатином, может быть выявлена только в присутствии плазмы
крови (в наших экспериментах - гомологичной).