Введение к работе
Актудьность проблемы. Белок фибриноген является основным компонентом системы свертывания крови. При поврежденцйи кровеносных сосудов генерируемы!} в месте повреждения рротеолИтический фермент тромбин превращает фибриноген в активную форму - мономерный фибрин. Последний способен спонтанно полимеризоваться с образованием фибриновой сети - основы кровяного сгустка. Система свертывания крови, несмотря на сложность и многокомпопентность, функционирует чрезвычайно эффективно, обеспечивая поддержание гемостаза. Однако, При различных патологических состояниях свертывание крови Может* нарушаться, что приводит к образованию внутрисосудистых тромбов или к обильным кровотечениям. Для борьбы с этими явлениями необходима знать тонкие молекулярные механизмы формирования фибриновой сети. Изучение самосборки фибрина представляет также большой теоретический Интерес, так как этот процесс яляется сравнительно простой моделью для выяснения механизмов формирования специализированных надмолекулярных структур.
Несмотря на большое количество данных по различным биохимическим аспектам формирования фибрннового сгустка, многие структурно-функциональные вопросы этого сложного процесса все еще остаются без ответа. Так, до сих пор не выяснена тонкая струкі"УР1,ая организация промежуточных продуктов полимеризации фибрина - протофибрилл. До конца не ясна роль центров полимеризации {Е2), активируемых при отщеплении фибринопелтидов В. Противоречивы Литературные данные о механизмах образования ранних олигомеров фибрина. Наконец, неоднозначно оценивается роль в процессе самосборки С-кшгЦеых уЧаСткОв Аа-цеией фибриногена.
Противоречивость результатов, полученных в разных лабораториях при изучении самосборки фибрина1, может быть оічасти объяснена тем, что большинство этих исследований проведено На систеЫе фибриноген + тромбин. Поскольку и активация фибриногена тромбином, и стадии самосборки фибрина не яляются дискретными процессаШ, а в нйчительной степени перекрывают друг друга, это усложняет их изучение и затрудняет интерпретацию и сопоставление результатов, полученных в различных экспериментальных условиях. Использование препаратЬв активированных форм фибриногена и его фрагментов (модеДЫШх систем) позволяет изучать процесс самосборки фйбрийа без его ферментативной фазы.
В связи с вьішеизложещіьім и возникла необходимость в Исследовании процесса самосборки фибрина На Модельных системах с привлечение^ современных методов электронной микросісЬгійи в сочетаний с различными биохимическими подходами.
Целью работы явилось изучение На модельных системых различных этапов процесса самосборки фибрина И роли егО отдельньіх Деіггров полимеризации в этом процессе. Ііри Выполнении работы НеобходЙмЬ было решить следующие задачи:
изучить процесс формирования И Tottityid структуру ранних продуктов полимеризаций MondMepitoro фибрина; '
исследовать на модельных системах роль Ej-uelrrpoB фибрина В процессе его самосборки; , ' :г ,
получить экспериментальные доказательства Предложенного ранее механизма участия аС-доменов молекул фибрина В процессе его самосборки; - на модельной системе изучить влияние ctC-доменов фибрина на процесс ветвления фибрилл,
Научная новизна рвботы. В результате проведенных исследований впервые показано,что длинные индивидуальные протофибриллы фибрина имеют твистируюидую структуру, предсказанную теоретически ранее. Показано, что процесс Образования* Олигоиеров фибрина на ранних стадиях самосборки носит упорядоченный характер, который определяется не разной скоростью отщепления фибринопептидов А, как было Предложено ранее, а другими механизмами. Установлено, что задержка в активации Ег-центров необходима для того, чтобы изменения, происходящие в молекуле фибрина при отщеплений фибринопептидов В, проявлялись больше на стадии латеральной агрегации, чем на ранних этапах самосборки фибрина. Впервые получены данные, экспериментально подтверждающие существование взаимодействия между аС-домеиами, возможность их внутримолекулярной ассоциации/ диссоциации и образования межмолекулярных аС-аС контактов. Доказано, что аС-Домены не определяют Процесс ветвления фибрилл, но их частичное Или полное отсутствие, приводит к увеличению толщины фибрилл, формирующих ГЕЛЬ.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты углубляют представления о молекулярных механизмах самосборки фибрина и могут быть использованы при построении модели процесса самосборки фибрина на молекулярном уровне.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на VIII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Звенигород, 1988), на ХШ Конгрессе Международного общества по тромбозам и гемостазу (Амстердам, 1991), на научных семинарах отдела структуры и функций белка Института биохимий им. А.В.Палладииа АН Украины и лаборатории д-ра Дж. Вайзеля (Филадельфия, 1991).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения, двух глав обзора литературы, описания Методов исследования, трех глав экспериментальных исследование Н их обсуждения, заключения, выводов. Список литературы содержит 172 источника. В диссертации 1 таблица и 20 рисунков.