Введение к работе
Актуальность проблемы. В результате.многолетних-исследований биохимической роли тиамина (витамина Bi) во внутриклеточном метаболизме сложилось представление, что сна не может быть сведена лишь к участию дйфосфорного эфира тиамина (ТДФ) в качестве кофермента в функционировании нескольких ферментов углеводного обмена. Основанием для такого предположения послужили следующие факты: 1. Наличие во всех тканях и клетках в качестве обязательных компонентов помимо ТДФ ряда некофер-ментных производных тиамина, в том числе, двух других его фосфорных зфиров - монофосфзта и трифосфата и ферментов их обмена. 2. Наличие у тиамина нейротропной функции, которую невозможно объяснить, основываясь только на каталитической роли ТДФ в метаболизме углеводов. 3. Выявление патологий, в частности генетической этиологии, обусловленных нарушением обмена -тиамина, не сопровождающимся изменением активности ТДФ-зависимых ферментов. Анализ перечисленных выше фактов указывал на наличие каких-то специфических функций тиамина в физиологических процессах, отличных от 'коферментных фушсций ТДФ, которые условно назвали некоферментными (Ostrowsky, 1968; Веппап & Fishman, 1975; Iwata H.,1982; Haas, 1988].
Считается, что механизм каталитического (коферментпого) действия тиамина изучен достаточно хорошо, хотя по мере совершенствования методов, применяемых в биохимических исследованиях, выявляются новые детали этого сложного процесса. В частности, в клетках микроорганизмов [Kondo & Ishimoto, 19753 обнаружен новый необычный ТДФ-зависимый фермент, принимающий участие в обмене серусодержащих соединений.
Более сложная ситуация складывается при изучении неко-ферментных механизмов участия тиамина в метаболизме. Исследователи, занимающиеся биохимией тиамина, в поисках его неко-ферментных функций выбирают различные подходы. Одни изучают свойства распространенных во всех живых тканях некоферментных форм тиамина и пути их взаимодействия с другими биологически активными молекулами [Островский и др.. 1971, 19751. Другие, исходя из предположения, что некоферментные биохимические функции тиамина должны быть связаны исключительно с его нейротропной Физиологической функцией, ищут молекулярные меха-
ниэмы участия тиамина и его производных в функционировании возбудимых мембран или в регуляции обмена нейромедиаторов CMatsuda, Cooper, 1983, 1985; Schoffeniels, Marginetu, 1984]. И хотя в этих исследованиях получено немало новых сведений об обмене тиамина и функционировании ТДФ-зависимых ферментов, до . сих пор представления о некоферментных механизмах участия тиамина в обмене веществ очень расплывчаты, и существуют лишь отдельные отрывочные сведения, не дающие однозначных ответов. Было показано, что помимо каталитической роли кофермент оказывает на ферменты "стабилизирующее" действие, молекулярные механизмы которого не расшифрованы [Рыбина и др., 1974]. Появились сообщения о возможности индукции или репрессии ТДФ-зависимых ферментных белков тиамином или его производным [Reunauer et all, 1971]. Было отмечено [Pandit & Chakrabarti, 19721, что уже на первых этапах развития Ві-авитаминоза наблюдается прогрессирующее снижение содержания в тканях восстановленного глутатиона, что само по себе могло способствовать снижению активности ТДФ-зависимых дегидрогеназ, в активных и регуляторных центрах которых содержатся SH-группы [Бунин и др., 1991] и чувствительность которых к уровню, восстановленного глутатиона в тканях была показана Штутман и др., 1975]. Более поздние работы показали возможность участия тиаминфосфатов в регуляции активности ТДФ-зависимых ферментов, в частности, пируватдегидрогеназного комплекса (ПДК) tAlkonyi et all., 1976; Roche & Cate, 1977] и кетоглутаратдегидрогеназно-го комплекса (КТДК) [Yusa, 1966] по механизмам, не связанным с коферментной функцией ТДФ. На основании экспериментальных данных высказываются предположения об участии тиаминфосфатов в реакциях трансфосфорилирования [Bettendorff & Schoffeniels, 1990] и окислительного фосфорилирования [Раэумович, Карпуть, 1969].
Идентификация некоферментных функций тиамина в физиологических условиях - довольно сложная задача, так как многие его эффекты на те или иные участки клеточного обмена опосредованы цепочкой метаболических превращений, берущих начало от субстратов или продуктов ТДФ-зависимых ферментных реакций, занимающих в большинстве случаев ключевое положение в обмене. Среди нескольких ферментов этой группы в организме животных наиболее важными в метаболическом аспекте являются транскето-
лаза и уже упоминавшиеся ЦЦК и КГДК. Кетокислоти, являясь субстратами для окислительного декарбоксилирования, могут подвергаться различным превращениям в организме. Они способны декарбоксшшроваться икарбоксйлироваться,-что в случае лиру-вата обеспечивает взаимосвязь гликолиза и глюконеогенеза. Благодаря способности к аминированию с образованием соответствующих аминокислот а-кетокислоти играют роль связующего звена между обменом углеводов и белков. Конечный продукт аэробного окисления глюкозы - ацетил-КоА, образующийся в результате пируватдегидрогеназнои реакции, окисляется далее в ЦТК или идет на построение кетоновых тел, липидов и, что особенно важно в аспекте выяснения нейротропнсіг функции тиамина,- нейро-медиатара аиетилхолина. В связи с вышесказанным, первоочередно!! задачей при расшифровке- путей регуляторного воздействия тиамина на клеточный метаболизм мы считаем изучение молекулярных механизмов участия его биологически активных производных в регуляции функционирования ТДФ-зависимых ферментов.
Актуальность исследований, направленных на выяснение новых аспектов участия тиамина в клеточном метаболизме, подтверждается растущим перечнем патологий, связанных с нарушением обмена тиамина, которые невозможно объяснить только кофер-ментной функцией ТДФ. Результаты таких исследований будут способствовать научно обоснованному применению производных тиамина в медицине, в частности, созданию принципиально новых форм нейроактивных лекарственных препаратов.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в выяснении биологической роли и механизмов участия тиамина и его производных в регуляции функционирования ТДФ-зависимых ферментных систем, и внутриклеточного обмена.
Решались следующие задачи:
в условиях различной обеспеченности организма животных 'тиамином и различной интенсивности его обмена проследить за-Бисіімость между уровнем тиамина и его фосфатов в тканях и активностью ТДФ-зависимых ферментов, в первую очередь - пирува-тдегидрогеназного комплекса (ПДК), занимающего ключевое положение в клеточном метаболизме;
провести исследование механизмов некоферментного действия тиаминфосфатов на функционирование ЩК на изолированных системах:
выяснить возможность регуляторного действия тиамина и тиаминфосфатов на функционирование ІЩК и, соответственно, синтез ацетилхолина в нервных клетках;
исследовать особенности обмена тиамина и его связь с обменом ацетилхолина в нервных окончаниях;
на основании полученных данных сформулировать представления о механизмах действия тиамина на функционирование ТДФ-зависимых ферментов (на примере ІЩК) в клетках тканей животных и провести экспериментальную проверку возможности функционирования этих механизмов in vivo;
на основании анализа совокупности всех полученных данных и данных литературы'провести обсуждение возможных механизмов нейротропного действия тиамина.
Научная значимость и новизна. В работе использованы принципиально новые подходы для выяснения некоферментных механизмов действия тиамина на ТДФ-зависимые дегидрогеназы а-кетокислот: исследована корреляционная зависимость между уровнем индивидуальных тиаминфосфатов и активностью этих ферментов в печени экспериментальных животных, отличающихся по уровню обеспеченности тиамином и по интенсивности его использования, обусловленной различной направленностью метаболических процессов. Установлено, что в нормальных условиях в печени животных отсутствует регуляция активности ТДФ-зависимых дегидрогеназ по механизму ассоциации-диссоциации кофермента и апофермента. В то же .время в условиях недостаточности тиамина важным компонентом регуляции активности этих ферментов становится тиол-дисульфидная система тканей; выявлено прямое, не зависящее от его коферментной функции, участие тиамина в поддержании равновесия этой системы.Прямая корреляция между уровнем кофермента и активностью ТДФ-зависимого фермента - КГДГ отмечена только при 10-кратном снижении концентрации кофермента по сравнению с контролем (кажущаяся Km определена равной 3,83±1,62 мкМ). Показано,что при физиологических, условиях ТДФ и ТТФ принимают участие в регуляции активности ПДК фосфорили-рованием-дефосфорилированием по механизму, не зависящему от коферментной функции ТДФ. ТДФ и ТТФ, связываясь с ПДК,оба ин-гибируют активность ПДТ-киназы,но действуют различным образом на активность ЩГ-фосфатаэы: ТДФ активирует ее при всех испытанных концентрациях, ТТФ оказываем нелинейное ингибирование.
4 .
Показана принципиальная возможность участия тиаминфосфа-тов по вышеописанному механизму в регуляции активности ГЩК в
нервных окончаниях мозга и, опосредованно через функциониро -
" вание'ПДК, - в регуляции синтеза АХ. Проведено комплексное изучение обмена тиамина и его связи с обменом АХ в нервных окончаниях.
Впервые выделен и охарактеризован по биологической активности тиаминсвязываший белок синаптосом, показана его причастность к обмену тиаминфосфатов и АХ.
На основании анализа собственных экспериментальных данных и данных литературы сформулирована оригинальная гипотеза относительно механизмов реализации н«йротропной функции тиамина, согласно которой тиамин ісвалифицирован как спутник ней-ромедиатора АХ.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные о некоферментной регуляции тиамином активности ТДФ-зависимых ферментов в тканях животных и вытекающая из результатов этих исследований гипотеза о природе нейротроп-ности тиамина имеют, прежде всего, приоритетное научно-теоретическое значение. Они позволяют с новых позиций оценить роль тиамина в клеточном метаболизме и являются основой для развития новых направлений в биохимии тиамина.
Разработано несколько новых биохимических методов и модификаций известных методов исследования обмена тиамина,в том числе новый метод разделения тиаминфосфатов на катионообмен-ном сефадексе, который "послужил основой для нескольких аналогичных разработок в мире.
Результаты данного исследования служат научно-теоретическим обоснованием создания новых препаратов тиамина и его производных в комбинации о другими биологически активными соединениями для медицины и ветеринарии. В частности, автором разработан препарат "Биометок", предназначенный для повышения жизнестойкости животных.который показал высокую эффективность при испытании.
Апробация. Основные положения диссертации доложены на
III (1977 г.), IV (1982 г.), V (1987 г.) и VI (1992 г.) Укра
инских биохимических съездах и III (1974 г.), IV (1979 г.) и V
(1986 г.) Всесоюзных биохимических'съездах; на III (1975 г.),
IV (1977 г.) и V (1983 г.) Гродненских симпозиумах;Всесоюзных
конференциях "Актуальные проблемы витаминологии"(Москва,1978), "Биохимия, фармакология и медицинское применение производных витаминов и других предшественников коферментов" (Иркутск, 1983), "Научные основы витаминного питания с/х животных" (Рига, 1987), "Клиническая витаминология" (Москва, .1991) и др. (всего 10), на нескольких республиканских конференциях; на шести Всесоюзных биохимических симпозиумах (1982-1990 гг); на Проблемной комиссии по витаминологии (Гродно, 1986), а также на международных конференциях: "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989) и "Биохимия и физиология ТДФ-зависимых.ферментов" (Влаубейрон, 1990).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), экспериментальной части (собственные исследования - 5 глав), обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы (473 источника,, в том числе 88 отечественных и 385 иностранных авторов). Работа изложена на 260 . страницах машинописного текста, включая 58 страниц списка литературы. Текст диссертации иллюстрирован 18 таблицами и 35 рисунками.