Введение к работе
Актуальность проблемы
В процессе дыхания энергия окислительно —восстановительных реакций превращается дыхательной цепью в разность электрохимических потенциалов ионов водорода на сопрягающей мембране. Цитохром с оксидаза (ЦО) является терминальным ферментом дыхательной цепи и играет ключевую роль в аэробном дыхании и преобразовании энергии у большинства эукариотов и многих микроорганизмов.
Фермент переносит электроны от цитохрома с на молекулярный кислород, восстанавливая последний до воды, и использует свободную энергию этой сильно экзергонической реакции для электрогенной транслокации протонов через мембрану. ЦО содержит 4 редокс — центра: 2 входных (СиА и гем а) и двухядерный железо —медный кислородоредуктазный центр (Сив и гем а3), который расположен в глубине фермента.
Каталитический цикл фермента длится несколько миллисекунд, в течение которых, как полагают, двухядерный центр ЦО проходит ряд промежуточных состояний, соответствующих последовательному 4-х электронному восстановлению молекулы кислорода до двух молекул воды (схема 1).
Схема 1 О i-=ie> R i^iLe> оху —> Р 1^де> р ±=йл> О
а33+ а3-+ аз2+-02 а^+~Ог2' а34+=02- а33+-ОН-
Ha схеме изображены состояния гема а3, о комплексе с которым происходят редокс — превращения кислорода.
С наружной стороны мембраны в железо — медный центр последовательно поступают 4 электрона, а из матрикса навстречу электронам поперек мембраны переносятся 4 протона, необходимые для образования воды (т.н. "химические" протоны), в результате чего образуется трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов водорода (ДцН + ). Кроме того, цитохромоксидазная реакция сопровождается транспортом через всю мембрану еще 4-х протонов на каждую молекулу восстановленного кислорода ("помповые" протоны). Динамика внутрибелкового переноса протонов и образования трансмембранного потенциала является, возможно, наиболее важной и в то же время наименее изученной областью исследований механизма работы цитохромоксидазы, а также других белков — генераторов ДцН"*".
Перспективным подходом в этом направлении является изучение с временным разрешением каждого из одноэлектронных переходов фермента. Такая возможность появилась в 1992 году, после того как Т.Нилсон впервые применил трис-бипиридиловый комплекс рутения(П) (RuBpy) для одноэлектронного фотовосстановления ЦО (Nilsson, 1992).
Кроме того, в лаборатории Ф.Миллетта (США) был получен ряд производных цитохрома с — физиологического субстрата цитохромоксидазной реакции, ковалентно модифицированного фотоактивными комплексами рутения. Результатом освещения лазерной вспышкой таких производных является фотовосстановление цитохрома с, что позволяет использовать их, как и RuBpy, для запуска светом цитохромоксидазной реакции.
В каталитическом цикле ЦО каждый из четырех одноэлектронных переходов включает в себя ряд частных электрогенных реакций. Такими реакциями могут быть: перенос электрона между редокс — центрами фермента, электрогенный захват протонов из внутренней водной фазы, а также электрогенный выброс протонов на другую сторону мембраны (если переход сопряжен с трансмембранным переносом протонов).
В 1993 году в нашей лаборатории удалось впервые реализовать измерение кинетики электрогенного переноса зарядов в ЦО (электрона и протонов), используя фотовосстановление фермента RuBpy в сочетании с разработанным Л.А.Драчевым "прямым" электрометрическим методом регистрации трансмембранной разности электрических потенциалов (ДЧ^). Были зарегистрированы электрогенные реакции, сопровождающие переход ЦО из соединения F фермента в окисленную форму (перенос 4 — го электрона в каталитическом цикле). В настоящее время исследование кинетики генерации трансмембранного потенциала в каталитическом цикле ЦО представляет собой одну из самых актуальных и интересных проблем в изучении этого фермента.
Принято различать в механизме протонного насоса ЦО два
основные узла. Во —первых: расположенные вокруг двухядерного центра
редокс —сопряженные группы, меняющие значения рК в зависимости от
восстановленности редокс —центров. Для каждого из одноэлектронных
переходов важно выявить окислительно — восстановительные
превращения редокс — центров, которые сопряжены с электрогенными реакциями захвата и выброса протонов этими группами.
Во —вторых: для проведения протонов внутри белка необходимы протонные "каналы", служащие для сообщения внутренней и внешней водной фазы с редокс—сопряженными группами. В 1995—1996 годах с помощью рентгеноструктурного анализа параллельно в двух лабораториях была получена трехмерная кристаллическая структура ЦО с разрешением 2.8 А. В гидрофобной толще белка выявлено существование как минимум двух разных протонпроводящих структур, соединяющих отрицательно заряженную водную фазу с двухядерным кислородоредуктазным центром и образуемых гидрофильными аминокислотными остатками и связанной водой.
В этих входных протонных "каналах" фермента обнаружено несколько высококонсервативных протонируемых аминокислотных остатка Е286, D132, К362 и Т359 (здесь и далее нумерация соответствует последовательности субъединицы [ цитохромоксидазы из Rhodobacter sphaaroides), замена которых путем направленного мутагенеза приводит к существенному снижению каталитической активности фермента .шбо полностью ингибирует ее. К362 и Т359 принадлежат к одному и тому же
протон —проводящему пути, который пересекает мембрану перпендикулярно ее поверхности и подходит непосредственно к одному из лигандов Cug, в то время как аминокислотные остатки D132 и Е286 локализованы в другом протонном "канале", идущем "мимо" кислородоредуктазного центра. Прямое измерение кинетики электрогенной транслокации протонов оксидазами с мутациями по аминокислотным остаткам в протонных "каналах" предоставляет возможность выявить роль данного остатка и "канала" в целом в переносе протонов внутри фермента.
Целью настоящей работы являлось выяснение механизма электрогенного внутрибелкового переноса протонов в цитохромоксидазной реакции. Для этого были поставлены следующие задачи:
Исследовать кинетику окисления — восстановления редокс — центров в F-Ю переходе митохондриальной ЦО и сравнить ее с кинетикой электрогенного переноса зарядов на этой стадии каталитического цикла.
Используя фотовосстановление ЦО с помощью RuBpy, выявить и охарактеризовать отдельные стадии электрогенного переноса электрона и протонов в переходе фермента из соединения Р в соединение F (т.е. в ходе переноса на кислород в каталитическом цикле ЦО третьего электрона).
Разрешить электрогенные стадии переноса электрона и протонов, сопровождающие переход F-+0 в каталитическом цикле бактериальной ЦО дикого типа из Rhodobacter sphaeroides.
Используя возможности направленного мутагенеза исследовать на примере ЦО из R. sphaeroides роль отдельных аминокислотных остатков в предполагаемых входных протонных "каналах" ЦО в электрогенном переносе протонов в ферменте.
Научная новизна работы. Показано, что при одноэлектронном фотовосстановлении соединения F цитохромоксидазы из сердца быка, переход оксоферрильного интермедиата гема а3 в окисленное состояние (соединение О) и трансмембранный перенос протонов оказываются разделены во времени. В этих условиях редокс — превращения в ЦО завершаются переносом электрона от гема а к гему а3 с характеристическим временем I мс в реакции {а2+ а34+=02~} —> {а3~ а33^-ОН-}.
Синхронно с этой редокс —реакцией фермент образует трансмембранную разность потенциалов, соответствующую по величине переносу одного протона (предположительно "химического") из матрикса в двухядерный центр на половину "электрической" толщины мембраны. Основная часть переноса протонов в ЦО, характеризующаяся значением т~4 мс, происходит уже после завершения окислительно — восстановительных превращений гема а3 и соответствует по амплитуде транспорту одного протона через всю мембрану и переносу на половину толщины мембраны еще одного протона. Предполагается, что восстановление кислородного аддукта гема а3 в F-Ю переходе
сопровождается первоначальным запасанием энергии в "напряженной" конформации белка, последующая релаксация которой сопряжена с трансмембранным переносом протонов ферментом.
Впервые описана кинетика генерации .мембранного потенциала цитохромоксидазой из сердца быка на стадии восстановления кислорода 3 —им электроном (переход P-»F). Фермент переводили в соединение Р предобработкой окисью углерода в аэробных условиях. Регистрируемый фотоэлектрический ответ содержит микросекундную нечувствительную к цианиду часть с характеристическим временем 40 — 50 мкс, соответствующую электрогенному восстановлению гема а входной медью (Сид), а также миллисекундную часть, несколько более быструю, чем в случае F->0 перехода. Аппроксимация экспериментальных кривых суммой трех экспонент дает: микросекундную компоненту с характеристическим временем -45 мкс и относительной амплитудой 30 — 3.5%, и две миллисекундные (чувствительные к цианиду) компоненты с т~0.6 мс и -3 мс и близкими вкладами в фотоэлектрический ответ.
Суммарный вклад миллисекундной цианид —чувствительной части
кинетики генерации потенциала при одноэлектронном
фотовосстановлении соединения Р соответствует переносу в двухядерныи центр из матрикса 1 протона, необходимого для образования молекулы воды, и транспорту двух протонов поперек мембраны: одного протона через всю толщину мембраны и другого — на 1/2 ее толщины.
Впервые измерена кинетика генерации мембранного потенциала бактериальной ЦО дикого типа и мутантных форм из Rsphaeroides при фотоиндуцированном одноэлектронном восстановлении фермента с помощью RuBpy. Регистрируемый фотоэлектрический ответ ЦО дикого типа в условиях одноэлектрониого фотовосстановления соединения F фермента содержит три компоненты набора потенциала с характеристическими временами -15 мкс, ~0.4 мс и ~1.5 мс и вкладами -30%, -20% и -50%.
Быстрая микросекундная фаза наблюдается для всех мутантных ЦО
из R. sphaeroides и отражает векторный перенос электрона с СиА на гем
а. Медленные фазы генерации потенциала отражают внутрибелковый
перенос протонов, сопряженный с восстановлением оксоферрильного
интермедиата гема а3 (F) гемом а до окисленного состояния, и включают
захват "химического" протона с цитоплазматической стороны мембраны,
необходимого для образования Fe3+—ОН- из Fe4+=02~ и
трансмембранный перенос "помповых" протонов. Замены
аминокислотных остатков К362М и Т359А в канале, предназначенном, как полагают, для переноса субстратных ("химических") протонов, практически не влияют на кинетику генерации потенциала ЦО, тогда как мутации остатков в "помповом" канале (D132N и в особенности E286Q) полностью подавляют миллисекундную часть фотоэлектрического ответа.
Для объяснения полученных результатов предлагается модель, основанная на раздельном функционировании протонных "каналов" на стадиях восстановления кислорода в цитохромоксидазе.
Практическое значение работы. Полученные результаты значительно расширяют современные знания о свойствах и функционировании цитохромоксидазы и могут оказаться полезными при изучении других протон —транспортирующих белков. В частности, важно выяснение механизма внутрибелкового проведения протонов в ЦО для понимания работы белковых ионных насосов. Детальный анализ восстановления кислорода в ЦО и его связь с механизмом работы пероксидаз дают ценную информацию о ферментативном превращении кислорода, необходимую для расшифровки путей регуляции кислородного метаболизма в клетке и для создания кислородных биосенсоров.
Адробапия работы. Диссертационная работа была апробирована на городском семинаре по биоэнергетике в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ (Москва 1997). Результаты также были представлены на 9 —ой Европейской Биоэнергетической конференции (Лувен —ла —Нев, Бельгия 1996), на 2 —ом Европейском Биофизическом конгрессе (Орлеан, Франция, 1997), а также на двух Гордоновских конференциях по биоэнергетике (1995, 1997).
Публикации. По материалам исследований опубликовано 5 печатных работ.
Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литература, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 2 схемами и 23 рисунками.
Материалы и методы.
Препарат цитохромоксидазы, выделенной из митохондрий бычьей сердечной мышцы по методике (Fowler et al., 1962), был любезно предоставлен Т.В.Выгодиной и А.В.Кириченко.
Мембраны и, в ряде случаев, препараты выделенных бактериальных цитохромоксидаз дикого типа и мутантных форм из Rhodobacter sphaeroides были предоставлены группой Р.Генниса (Иллинойский университет, Урбана, США) в рамках совместного проекта по изучению механизма переноса протонов в цитохромоксидазе. Выделение из мембран бактериальной цитохромоксидазы, содержащей полигистидиновую ручку, проводили методом аффинной хроматографии на Ni —NTA агарозе (Mitchell et al., 1995). Активность ЦО определялась спектрофотометрически по скорости окисления 30 мкМ цитохрома с в 50 мМ КН2Р04 буфере (рН = 6.5), в присутствии 0.02% лаурил мальтозида, при 25* С.
Дрожжевой цитохром с, модифицированный по остатку cys—102 трис —бипиридил—рутениевым комплексом был предоставлен Ф.Миллетом (Арканзасский университет, Файетвилль, Арканзас, США.).
Протеолипосомы, содержащие ЦО из митохондрий сердца быка либо из R.sphaeroides, получали методом диализа (Raker, 1972). Раствор фосфолипида ("азолектин") в холате смешивали с белком в соотношении около 40:1.
Электрометрические измерения:
Быструю кинетику образования разности потенциалов митохондриальным и бактериальными ферментами на мембране протеолипосом регистрировали прямым электрометрическим методом с разрешением 100 не (Drachev et al., 1989), адаптированным д\я измерений на цитохромоксидазных протеолипосомах (Zaslavsky et al.. 1993).
На отверстие (d = 4 мм), разделяющее 2 отсека тефлоновой ячейки для электрометрических измерений, наносили коллодиевую пленку, смоченную в декановом растворе фосфолипида (99 % лецитина, 50 мг/мл, и стеариламина, 1мг/мл). Ячейку заполняли 10 мМ HEPES —К.ОН, рН = 7.4. В один из отсеков ячейки вносили липосомы с цитохромоксидазой, добавляли в оба отсека 30 мМ сульфата магния и инкубировали 3 — 5 часов при постоянном перемешивании.
В этих условиях липосомы со встроенным ферментом сорбировались на поверхности мембраны, разделяющей два отсека ячейки. После инкубации липосомы, не связавшиеся с коллодиевой пленкой, удалялись путем замены объема ячейки с помощью перистальтического насоса, и оба отсека заполнялись конечной буферной средой для измерений (5 мМ Трис/ацетат, рН = 8.1).
Разность потенциалов в отсеках регистрировали при помощи защищенных от света Ag/AgCI электродов. Сигнал поступал в операционный усилитель (Burr—Brown) и затем через аналого-цифровой преобразователь DL—1080 (Datalab, England) в компьютер (РС486).
Для одноэлектронного фотовосстановления цитохромоксидазы в электрометрическую ячейку непосредственно перед измерением добавляли трис —(2,2'бипиридил)рутений(11)хлорид (RuBpy) (Nilsson, 1992). RuBpy, как катион, связывается с ЦО в месте посадки на фермент цитохрома с. Фотовозбуждение RuBpy достигалось лазерной вспышкой (вторая гармоника YAG — лазера (Quantel, 481): длина волны 532 нм, длительность импульса 15 не, мощность 40 мДж). В ответ на вспышку возбужденный RuBpy восстанавливает входную медь цитохромоксидазы (Си^) менее, чем за 1 мкс. Образующийся окисленный RuBpy(III) ревосстанавливается присутствующим в среде анилином (10 мМ), что делает фотовосстановление цитохромоксидазы необратимым.
Для изучения кинетики генерации мембранного потенциала в P->F переходе фермент переводили в перекисное состояние
(Соединение Р). Для этого через липосомный отсек электрометрической ячейки в течение 1 минуты продували окись углерода (Nicholls, 1981).
Для обработки кинетических кривых и разложения их на экспоненты использовали программу "Discrete" (Provencher, 1976) и GIM (Grafic Interactive Managment), разработанную А.Л.Драчевым.
Оптические измерения:
Кинетику спектральных изменений при фотохимическом восстановлении ЦО RuBpy регистрировали на препарате изолированной митохондриальной цитохромоксидазы, переведенной в обессоленный буфер (Fry et al., 1978).
Измерения проводили в кварцевой микрокювете с длиной оптического пути (3*3 мм либо 4*4 мм). Монигорный свет от галогеновой лампы мощностью 70 вт попадал в термостатируемое кюветное отделение после решеточного монохроматора фирмы Jobin Won с шириной щели 2 — 3 мм. Измерения проводились в об.ласти 410 — 450 нм. Пройдя через образец свет поступал через призменный монохроматор на фотоумножитель. Оцифровка сигнала с фотоумножителя происходила с помощью аналого-цифрового преобразователя DL— 1080 (Datalab, England). Далее сигнал заводился в компьютер.
Д\я возбуждения RuBpy, также как и в электрометрических измерениях, использовалась вторая гармоника YAG — лазера (Quantel). Мощность вспышки составляла 50—100 мДж. Для увеличения отношения сигаал/шум проводили накопление 50 — 250 кривых с интервалом 5 секунд. Возбуждающий свет с помощью отражающего зеркала подавался в кюветное отделение, в область прохождения через образец мониторного света перпендикулярно последнему.
Стационарные спектры поглощения препарата фермента регистрировали па спектрофотометре SLM —Aminco DW2000, используя кювету с длиной оптического пути 1 см.