Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 7
1. Морфология, функции и особенности микроциркуляции тонкого кишечника 7
1.1.Морфология тонкокишечной стенки 7
1.2. Строение ворсинок и крипт 9
1.3. Функции тонкого кишечника 11
1.4. Особенности кровообращения и микроциркуляции тонкого кишечника 12
2. Этиология и патогенез ишемически-реперфузионного (И-Р) поражения тонкого кишечника 14
2.1 Этиология И-Р поражения тонкого кишечника 14
2.2. Патогенез И-Р поражения тонкого кишечника 17
2.2.1 Биохимические основы окислительного стресса 17
2.2.2. Патогенез микроциркуляторной дисфункции 22
2.2.3. Патогенез И-Р поражения тонкого кишечника 25
3. Антиоксидантные системы организма 27
3.1. Ферментативное звено 27
3.2. Семейство пероксиредоксинов (Prxs)
3.2.1. Характеристика семейства Prxs. 30
3.2.2. Роль Prxs в защите клеток млекопитающих от окислительного стресса 33
3.3. Пероксиредоксин 6 и медицинские аспекты его применения 35
II. Материалы и методы 41
1.Материалы 41
2. Методы 42
2.1. Модели И-Р поражения у крысы 42
2.1.1. Модель странгуляционной тонкокишечной непроходимости 43
2.1.2. Модель окклюзии верхней мезентеральной артерии
2.2. Приготовление гистологического препарата 45
2.3. Иммуногистохимический анализ 46
2.4. Иммуноферментный анализ 47
2.5. Флуоресцентная микроскопия сосудов тонкого кишечника 48
2.6. Лазерная допплеровская флоуметрия 48
2.7. Электрофорез и иммуноблотинг 50
2.8. Измерение концентрации оксида азота в сыворотке крови 51
2.9. Биохимический анализ крови
2.10. Анализ уровня экспрессии генов 51
2.11. Статистические методы 52
III Результаты исследований 53
1. Ишемически-реперфузионное поражение тонкого кишечника крысы 53
1.1. Сравнительная характеристика разных моделей И-Р поражения тонкого кишечника крысы 53
1.1.1 Модель странгуляционной тонкокишечной непроходимости 53
1.1.2. Модель окклюзии верхней мезентеральной артерии 55
1.2. Динамика развития И-Р поражения тонкого кишечника и питающих его сосудов 57
1.2.1. Состояние тонкого кишечника при И-Р поражении 58
1.2.2. Развитие поражения кишечной ткани при И-Р 60
1.2.3. Состояние микроциркуляционного русла тонкого кишечника при И-Р поражении 62
1.2.4. Состояние сосудов брыжейки при И-Р поражении 66
1.3. Динамика экспрессии основных маркерных генов при И-Р поражении 70
1.3.1. Динамика экспрессии генов для белков, ответственных за гибель и пролиферацию клеток при И-Р поражении
1.3.2. Динамика экспрессии генов антиоксидантной системы при И-Р поражении 72
2. Эффект экзогенного пероксиредоксина 6 (Prx6) при И-Р поражении тонкого кишечника 75
2.1. Распределение Prx6 в кишечной ткани 75
2.1.1. Распределение эндогенного Prx6 75
2.1.2. Распределение экзогенного Prx6 77
2.2. Влияние экзогенного Prx6 на развитие И-Р поражения тонкого кишечника и питающих его сосудов 79
2.2.1. Протекторный эффект экзогенного Prx6 при И-Р поражении тонкого кишечника обусловлен его пероксидазной активностью 80
2.2.2. Влияние экзогенного Prx6 на морфологию кишечной ткани при И-Р 82
2.2.3. Влияние экзогенного Prx6 на состояния микроциркуляторного русла тонкого кишечника при И-Р поражении 84
2.2.4. Влияние экзогенного Prx6 на состояние сосудов брыжейки при И-Р поражении 87
2.3. Влияние экзогенного Prx6 на уровень экспрессии маркерных генов при И-Р поражении 90
2.3.1. Влияние экзогенного Prx6 на уровень экспрессии генов, ответственных за гибель и пролиферацию клеток при И-Р поражении 90
2.3.2. Влияние экзогенного Prx6 на уровень экспрессии генов антиоксидантной системы при И-Р поражении 92
IV. Обсуждение результатов исследований 96
Заключение 109
Выводы 111
Публикации по теме диссертации 112
Список цитируемой литературы
- Особенности кровообращения и микроциркуляции тонкого кишечника
- Антиоксидантные системы организма
- Приготовление гистологического препарата
- Состояние тонкого кишечника при И-Р поражении
Введение к работе
Актуальность проблемы. Ишемия – патологический процесс, который развивается при снижении уровня кровообращения в органе на 50% от его нормальных значений, что приводит к развитию гипоксии. Однако губительным для клеток является не отсутствие кислорода, а его появление после гипоксии – реперфузия. Реперфузия приводит к резкому повышению концентрации кислорода в ткани, что способствует образованию активных метаболитов кислорода и повреждению ткани [Капелько В.И., 2005].
С проблемой ишемически-реперфузионного (И-Р) повреждения связаны многие клинические случаи: острые абдоминальные патологии, кардиохирургические и сосудистые вмешательства, послеоперационные осложнения. Факт И-Р поражения особенно важен при операциях по трансплантации кишечника [Yandza T., 2012].
Одной из причин поражения тонкого кишечника является мощный окислительный стресс, а гиперпродукция активных форм кислорода (АФК) – основной фактор, запускающий механизм апоптоза и некроза , 2014]. В здоровом организме антиоксидантный статус поддерживается набором ферментов-антиоксидантов, однако при реперфузии в условиях гиперпродукции АФК эта система ферментов-антиоксидантов не способна в полной мере справится с нейтрализацией свободно-радикальных процессов [Меньщикова Е.Б., 2008]. Изучение функционирования этих антиоксидантных систем является одним из принципиальных моментов в понимании механизмов патогенеза И-Р кишечника. Другим моментом является проблема снижения этого поражения с помощью экзогенных ферментов-антиоксидантов.
Одним из кандидатов на роль протектора кишечной ткани от И-Р поражения является
фермент - антиоксидант пероксиредоксин 6 (Prx6). В настоящий момент Prx6 представляет
интерес исследователей в качестве потенциального лекарственного препарата
антиоксидантного действия [Novoselov V.I., 2008].
Понимание фундаментальной роли фермента – антиоксиданта Prx6 в снижении поражения позволит определить возможности его практического применения для сохранения функциональной активности кишечника при И-Р поражении.
Цель исследования. Целью данной работы было выявление протекторных свойств пероксиредоксина 6 в защите тонкого кишечника при ишемически-реперфузионном поражении.
Основные задачи исследования
1. Провести сравнительную характеристику моделей И-Р поражения тонкого
кишечника.
2. Исследовать динамику развития И-Р поражения тонкого кишечника и питающих его
сосудов.
3. Определить влияние экзогенного пероксиредоксина 6 на динамику развития И-Р
поражения тонкого кишечника и питающих его сосудов.
4. Исследовать антиоксидантный статус кишечной и сосудистой ткани при И-Р
поражении и в условиях применения экзогенного пероксиредоксина 6.
Новизна научной работы. Впервые показано протекторное действие экзогенного Prx6 при И-Р поражении тонкого кишечника, включающем в себя сохранение структуры эпителия тонкого кишечника и сосудов брыжейки. Восстановление микроциркуляции в кишечнике к концу реперфузионного периода при использовании Prx6 проявляется на фоне сохранения слизистой оболочки во всем кишечнике. Протекторный антиоксидантный эффект Prx6 определяется его пероксидазной активностью.
Впервые показано, что эффект экзогенного Prx6 на состояние сосудов брыжейки при И-Р поражении выражается в снижении поражения эндотелия сосудов и сохранении миогенного тонуса на фоне усиления экспрессии генов NO-синтаз и изменения метаболизма оксида азота.
Впервые показано, что в основе протекторной роли Prx6 от поражения и гибели клеток кишечной и сосудистой ткани при И-Р лежит общий механизм, который связан с уменьшением апоптоза и увеличением регенеративной способности ткани. Данные процессы проявляются на фоне нормализации экспрессии генов ферментов - антиоксидантов, что является критерием снижения гиперпродукции АФК.
Научно-практическая ценность. Тот факт, что Prx6 обладает протекторной антиоксидантной активностью в организме, обеспечивает стимул для дальнейшего исследования его защитного механизма в организме при свободно-радикальных патологиях. Понимание фундаментальных основ этого механизма является первым шагом для внедрения Prx6 в медицину по двум направлениям. Первое - пероксиредоксины могут выступать основой для фармакологических препаратов, направленных на восстановление редокс-статуса в поврежденной ткани. Второе - модификации перфузионных сред, используемых для сохранения изолированных органов перед трансплантацией, в том числе тонкого кишечника.
Реперфузия изолированных органов перед трансплантацией средами, содержащими пероксиредоксины, может существенно увеличить антиоксидантный статус органа, что значительно уменьшит реперфузионное повреждения органа после трансплантации.
Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на конференциях: 18-я Международная Пущинская школа - конференция молодых ученых БИОЛОГИЯ – НАУКА XXI ВЕКА. – Россия, г. Пущино, 21-24 апреля, 2014; 19-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых БИОЛОГИЯ – НАУКА XXI ВЕКА. – Россия, г. Пущино, 20-24 апреля, 2015; 11-й Международный междисциплинарный конгресс Нейронаука для медицины и психологии. – Судак, Крым, Россия, 6-12 июня, 2015; IX Международная конференция «Биоантиоксидант». - г. Москва, 20 сентября - 2 октября 2015; V Съезд биофизиков России –г. Ростов-на-Дону, 4-10 октября 2015; II Конгресс по регенеративной медицине – г. Москва, 3-5 декабря 2015; 20-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых БИОЛОГИЯ – НАУКА XXI ВЕКА. – Россия, г. Пущино, 18-22 апреля, 2016 .
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ из них 7 статей и 8 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 133 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работу иллюстрируют 46 рисунков. Библиография включает 205 наименований.
Особенности кровообращения и микроциркуляции тонкого кишечника
Исследования фундаментальных основ И-Р поражения выявили каскад реакций, вовлеченных в патогенез поражения структур кишечника. Реперфузионное поражение связывают с активными метаболитами кислорода, активацией оксидант-продуцирующих ферментов слизистой оболочки, высвобождением липидных аттактантов из пораженных клеточных мембран, нарушением метаболизма оксида азота, фильтрацией нейтрофилов, активацией системы комплимента и воспалительных цитокинов, микроциркуляторной дисфункцией и др. [Mallick I.H. et al., 2004; Gonzalez L.M. et al., 2015; Granger D.N. et al., 2015]. Микроциркуляторные нарушения - первичное звено в проявлении и распространении ишемически-реперфузионного поражения тонкого кишечника [Vollmar B. et al., 2011].
В настоящее время считается общепризнанным, что одной ведущих причин разрушения кишечника при И-Р повреждении является мощный окислительный стресс, возникающий в эпителии при восстановлении кровотока, а бесконтрольное производство активных форм кислорода (АФК) – основной фактор, запускающий механизм апоптоза, некроза и перекисного окисления липидов, что в итоге ведет к поражению клеток. [Cerqueira N.F. et al., 2005; Bhattacharyya A. et al, 2014; Granger D.N. et al., 2015].
Концепция, что АФК играют приоритетную роль в И-Р поражении базируется на трех доказательствах: (1) мероприятия, которые обеспечивают детоксикацию АФК снижают степень поражения, (2) искусственное производство АФК в нормальных тканях резюмирует ответ на И-Р поражение, и (3) выявление повышенной продукции АФК и их характерные клеточные «следы» в постишемических тканях [Granger D.N. et al., 2015].
Окислительный стресс (ОС) – это нарушение баланса между системами, продуцирующими АФК и системами их илиминирующими. При окислительном стрессе в клетке происходит активация процессов, которые обеспечивают либо её выживание, либо приводят к гибели через апоптоз или некроз [Ланкин В.З. и др., 2001].
К АФК относят кислородсодержащие радикалы - супероксид анион - радикал (O2-), гидроксил-радикал (HO), гидропероксидный радикал (HO2), оксид азота (NO), а также нерадикальные компоненты - пероксид водорода (H2O2) и гипогалогениды (HOCL, HOBr). Несмотря на то, что H2O2 и HOCL свободными радикалами не являются, они взаимодействуют с органическими молекулами по радикальному механизму, а в присутствии ионов железа и супероксида способны быстро разлагаться с образованием HO в реакциях Фентона и Хабера – Вайса [Ланкин В.З. и др., 2001]. Из потенциальных источников АФК, описанных к настоящему времени, ферменты ксантиноксидаза и НАДФН - оксидаза (Nox), митохондрии и индуцибельная N0 - синтаза получили статус участников окислительного стресса, индуцированного реперфузией [Granger D.N. et al., 2015]. Хотя все четыре источники присутствуют в большинстве тканей, внимание исследователей направлено на конкретные источники АФК, которыми обогащены определенные ткани. Например, ксантиноксидаза в желудочно-кишечном тракте [Harrison К, 2002] и N0 - синтаза в эндотелиальных клетках [Perkins К.А. et al., 2012; King A.L. et al., 2014].
Недостаток кислорода в ткани приводит в первую очередь к нарушению окислительного фосфорилирования в митохондриях и прекращению синтеза АТФ в клетках. Для поддержания внутриклеточного уровня АТФ происходит активация анаэробного гликолиза. Энергоемкие фосфаты распадаются до аденозина. Он после диффузии в интерстициальное пространство, метаболизируется до инозина и гипоксантина. Гипоксический стресс запускает преобразование фермента ксантиндегидрогеназы в ксантиоксидазу из-за нарушения баланса кальция в клетках и активации кальций - зависимых протеаз [Капелько В.И., 2005].
Ксантиноксидоредуктаза (XOR) (рис. 3) представляет собой комплекс молибден-содержащих ферментов, который опосредует реакции гидроксилирования ксантина в мочевую кислоту. Этот фермент существует в двух взаимообратимых формах -ксантиндегидрогеназы (XDH) и ксантиноксидазы (ХО), с XDH в качестве преобладающей формы в здоровой ткани. XDH предпочтительно использует НАД+ в качестве акцептора электронов, в то время как ХО использует молекулы кислорода в качестве конечного акцептора электронов, тем самым генерируя АФК [Granger D.N. et al., 2015].
Отсутствие кислорода является не так опасно для клеток, как его повторное появление при реперфузии органа. Появление кислорода в ишемизированном органе инициирует каскад событий, приводящих к дополнительному повреждению органа, называемому реперфузионным. В течение реперфузии молекулярный кислород проникает в ткани, где ксантиноксидаза использует его в качестве акцептора электронов, метаболизируя гипоксантин и производя супероксид. Это приводит к взрыву производства свободных радикалов кислорода, таких как супероксид анион 02 и перексид водорода Н202 [Harrison R, 2002; Bhattacharyya A. et al., 2014]
Полностью собранный фермент генерирует супероксид анион с помощью одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода и цитоплазматического НАДФН в качестве донора электронов [Lambeth J.D. et al., 2008; Bhattacharyya A. et al., 2014].
Семейство НАДФН - оксидаз представлено 7 членами: Nox 1 – 5 и Duox 1 – 2 [Kahles T. et al., 2013]. Предположение, что семейство НАДФН - оксидаз способствует реперфузионному повреждению основано на двух видах доказательств: (1) повышение экспрессии и/или активности Nox в постишемической ткани и (2) уменьшение АФК при фармакологическом ингибировании [Nakagiri A. et al., 2007] или генетическом ингибировании активности Nox [Ishikawa M. et al., 2004; Loukogeorgakis S.P. et al, 2010].
Кроме того, лейкоциты буквально начинены миелопероксидазой. Она также является источником АФК. Этот фермент инициирует образование гипогалогенитов (HOCL, HOBr). Они окисляют сульфгидрильные и тиоэфирные группы белков, железосерные центры и гемовые группы ферментов, при этом высвобождается железо в активной форме (Fe2+) [Менщикова Е.Б. и др., 2008].
Электронный парамагнитный резонанс показал, что повышение образования АФК при И-Р поражении регистрируется в тканях уже через 20 секунд, а супероксид радикал служит предшественником для гидроксильных радикалов и других АФК [Raedschelders К. et al., 2012].
Супероксид анион (Ог-) спонтанно быстро дисмутирует в кислород O2 и пероксид водорода Н202 (скорость реакции 105 М"1 s"1 при рН 7.0). Тем не менее, О2- ещё быстрее реагирует с другими молекулами-мишенями, такими как радикал оксида азота NO.
Эндогенный кислородный радикал оксид азота можно отнести к АФК. Хотя 02" и N0 малоактивные радикалы, они эффективно взаимодействуют, образуя при этом сильный окислитель пероксинитрит и высокоактивный гидроксил - радикал НО: N0 + О2" ONOO" + Н+ ONOOH НО + N02. Пероксинитрит участвует в реакциях нитрозилирования белков, в перекисном окислении липидов (ПОЛ), повреждении ДНК и в индукции апоптоза [Ланкин В.З. и др., 2001].
Оксид азота образуется в результате окисления аминокислоты L-аргинина под влиянием фермента NO-синтазы (NOS). Выделяют три изоформы NO-синтаз: нейрональную (nNOS или NOS I), эндотелиальную (еNOS или NOS II) и макрофагальную (индуцибельную) (iNOS или NOS III). Все изоформы NOS содержат оксигеназный и редуктазный домены (рис. 4). В основе функционирования фермента лежит совместная работа двух доменов в димере. Электроны от кислорода передаются от редуктазного домена к оксигеназному, таким образом, происходит редукция кислорода в сочетании с генерацией NO [Forstermann U. et al., 2006, 2012]. В результате структурных и функциональных (недостаток кофакторов) перестроек происходит разобщение NOS доменов в мономере. В итоге, поток электронов от кислорода отделен от окисления
Рис. 4. Мономерная и димерная форма NOS [Granger D.N. et al., 2015]. аргинина. Таким образом, NOS превращается в фермент генерирующий О2-.
Антиоксидантные системы организма
Однако основной цикл работ по исследованию Prx6 в функционировании организма указывает на его доминирующую роль в защите от окислительного поражения органов [Volkova A.G. et al., 2014, Gordeeva A.E. et al., 2015; Palutina O.A. et al., 2015]. Роль Prx6 была продемонстрирована в работах с нокаутированными по гену prx6 мышами. Такие мутанты имели низкую выживаемость, поражение органов, высокий уровень окисления белков. При этом у нокаутов по prx6, уровень экспрессии других генов антиоксидантных ферментов не отличался от такового у мышей дикого типа [Wang X. et al., 2003]. Результаты этих исследований позволяют предполагать, что функция Prx6 не может быть скомпенсирована экспрессией других генов.
Применение экзогенного Prx6 успешно используется для повышения антиоксидантного статуса в ткани при свободно-радикальных патологиях [Novoselov V.I. et al., 2008; Volkova A.G. et al., 2014, Gordeeva A.E. et al, 2015; Palutina O.A. et al., 2015]. Этот аспект применения Prx6 основан на том, что в условиях гиперпродукции АФК собственная антиоксидантная система не способна в полной мере справиться с нормализацией свободно-радикальных процессов [Меньщикова Е.Б. и др., 2008]. В этом случае одним из способов снижения избытка АФК является повышение антиоксидантного статуса в поврежденной ткани, путем применения экзогенных ферментов-антиоксидантов и других агентов, обладающих антиоксидантными свойствами.
К настоящему времени описаны протекторные свойства ряда агентов в отношении защиты тонкого кишечника от реперфузионного поражения. Так показано, что введение ингибитора ксантиноксидазы аллопуринола, перед И-Р снижает производство АФК и поражение в тонком кишечнике, тем самым защищая слизистую оболочку кишечника [Sapalidis K. et al., 2013]. Есть данные о протекторном действии синтетического – опиоида ремифентанила [Cho S.S. et al., 2013]. В ряде работ используются другие агенты, которые при их использовании до И-Р поражения тонкого кишечника проявляют протекторный эффект: антиоксидантная молекула lazaroid (21- amino steroid) U-74389G [Flessas I. et al., 2015], селен [Kim Y. et al., 2014]; инфиксимаб [Pergel A. et al., 2012]. Главный недостаток исследуемых в настоящее время антиоксидантных агентов - их косвенный механизм действия на баланс редок-с системы, что существенно снижает их эффективность перед Prx6. Непосредственные ингибиторы гиперпродукции АФК -пропофол (2,6-diisopropylphenol) и темпол. Первый имеет антирадикальную активность сходную с действием эндогенного антиоксиданта -токоферола (витамина Е). Как показали исследования, обработка пропофолом способствует ингибированию НАДФН -оксидаз и снижению поражения кишечника [Liu K.X., 2007; Gan X., 2015]. Темпол – миметик SOD. Его протекторная роль в снижение И-Р поражения показана для разных тканей, в том числе для кишечника [Barber I. et al., 2009; Zhang G. et al., 2016].
Подтверждена высокая эффективность использования экзогенного Prx6 в терапии целого ряда экспериментальных патологий (химические и термические ожоги кожи и органов дыхания, И-Р поражение почек и др.). Кроме того, Prx6 является мощным природным радиопротектором [Шарапов М.Г. и др., 2016].
Исследование терапевтических свойств экзогенного Prx6 в лечении резаных ран показало, что в резаной ране возрастает уровень экспрессии гена prx6. Основным источником белка были молодые фибробласты, которые в большом количестве появляются в пораженной ткани. Применение экзогенного белка при лечении резаной раны показало, что происходит ускорение её заживления, при этом рубец был меньше [Новоселов В. И. и др., 2003].
Медицинские аспекты применения Prx6 были показаны при термическом ожоге трахеи. Было продемонстрировано, что в данных условиях возрастает уровень эндогенного Prx6, источником которого являются бокаловидные клетки. Таким образом, активация синтеза собственного Prx6 - ключевое звено в активации защитных систем в эпителии после термического ожога. После аппликации экзогенного Prx6 в пораженную трахею наблюдалось снижение поражения эпителия, с другой стороны была отмечена высокая регенерационная способность ткани. Практически полное восстановление эпителия происходило в течение 2-х недель [Novoselov V.I. et al., 2008].
Значительный терапевтический эффект Prx6 был показан при лечении поражения верхних дыхательных путей, вызванного химическим ожогом, в частности, ожогом парами соляной кислоты. Морфологическая оценка эпителия верхних дыхательных путей показала, что на фоне применения Prx6 уменьшается количество пораженных клеток. Авторы показали, что время, при котором аппликация ферментов-антиоксидантов еще эффективна, составляет 4-5 часов после химического ожога [Volkova A.G. et al., 2014].
Была исследована терапевтическая роль Prx6 при лечении патологий почечной ткани, в частности показано нефропротекторное действие белка при разной тяжести ишемически-реперфузионного повреждения тканей почек. Внутривенное введение фермента-антиоксиданта Prx6 опосредовало сохранение морфологической картины почки, нормальные уровни креатинина и мочевины в крови, уменьшение степени апоптоза в ренальных тканях. Авторы сделали предположение о потенциальной возможности использования такого антиоксиданта для сохранения структуры и функциональной активности ренального трансплантанта от И-Р синдроме [Palutina O.A. et al., 2015]. Положительный кардиопротективный эффект введения Prx6 в перфузионные растворы был показан на изолированном сердце. Кардиопротективный эффект выражался в нормализации пульса, поддержании сократительной активности миокарда и предотвращении ПОЛ при оксидативном стрессе [Karaduleva E.V. et al., 2015].
В медицинском отношении антиоксидантная роль Prx6 продемонстрирована также со стороны защиты от радиоактивного излучения. Показано, что Prx6 является природным радиопротектором при облучении мышей в летальной дозе 7-10 Гр. Средняя продолжительность жизни облученных мышей составила 7 суток, а максимальное время дожития 13 суток. Введение Prx6 до воздействия рентгеновского излучения существенно увеличило выживаемость мышей. Около 95% животных остались живыми в течение 30 суток. Таким образом, Prx6 повышает устойчивость клеток к радиационным повреждениям, существенно предотвращая их гибель, в частности, показана протекторная роль Prx6 в отношении кишечного тракта. У облученных мышей отмечено острое поражение кишечной стенки: тотальная атрофия ворсинок и крипт (отмечено « »), слущивание энтероцитов (отмечено «») и разрушение всех оболочек кишечной стенки (отмечено «») (рис. 7 А). Введение в кровь Prx6 перед облучением повышает устойчивость клеток к радиационным повреждениям. Была отмечена сохранность энтероцитов, ворсинок и крипт (отмечено «+») и общей архитектуры кишечной стенки (отмечено «--») (рис. 7 B) [Шарапов М.Г. и др., 2016].
Приготовление гистологического препарата
Электрофорез белков в денатурирующих условиях проводили на оборудовании Mini Vertical Unit («Amersham», США), по стандартной методике Laemmli [Laemmli U.K., 1970]. В работе использовали 5% концентрирующий и 12,5% разрешающий полиакриламидные гели (ПААГ) на Трис-буфере (130мМ Трис-HCl, рН 6.8 – для концентрирующего геля и 375мМ Трис-HCl, рН 8.8 – для разрешающего геля), содержащие 0.1% SDS, 0.1% PSA и 0.08% TEMED.
Подготовка проб включала получение сыворотки крови. Для этого проводили центрифугирование цельной крови в течение 10 мин (14000 g). Для разделения белков в пластинах геля на каждую его дорожку наносили по 5 мкл солюбилизированной сыворотки крови. Вхождение белка в гель осуществляли при силе тока 15 мА, а разделение при силе тока равной 25-30 мА. В качестве белков-маркеров использовали Unstained Protein Molecular Weight Marker фирмы «Fermentas life sciences» (США).
Для иммуноблота белки, разделенные в 12,5% SDS ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C («Amersham», США) с помощью прибора для полусухого переноса («Bio-Rad», США) при силе тока не превышающей 2мА/см2 Мембрану обратимо окрашивали 2% раствором Ponсeau S («Sigma», США). Затем мембрану инкубировали в буфере для гибридизации - 5% сухом молоке на PBS («Amresco», США) 12 ч при t = 4С, для предотвращения неспецифического связывания антител. Далее мембрану инкубировали в том же буфере для гибридизации с добавлением первичных моноклональных антител мыши к Hisag домену Prx6 («USBiological», США) (1:1000) в течение ночи при t = 4С. Для иммуномечения экзогенного Prx6 – Hisag использовали конъюгаты вторичных антител с щелочной фосфатазой («AbD serotec» Великобритания) в разведении 1:3000. Инкубация в течение 1 часа при t = 37С. Связавшиеся антитела детектировали с помощью готового субстрата для щелочной фосфатазы BCIP/NBT (BCIP/NBT, «Roche», США) в соответствии с рекомендациями производителя.
Продукцию NO в сыворотке крови крысы измеряли по концентрации нитритов, являющихся конечным продуктом метаболизма короткоживущего соединения NO. Количество нитритов измеряли с использованием реактива Грисса, содержащего 0,1% раствора N-нафтил-этилендиамин дигидрохлорида в 2,5% растворе фосфорной кислоты и 1% раствора сульфаниламида в 2,5% фосфорной кислоты в соотношении 1:1. Для этого кровь центрифугировали в течение 5 мин на скорости 14000 g. Образцы сыворотки помещали в 96-луночный планшет (100 мкл на лунку), добавляли 100 мкл свежеприготовленного реактива Грисса и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Оптическую плотность измеряли на приборе Multiskan (Labsystem Plus, Финляндия) при длине волны 546 нм.
2.9. Биохимический анализ крови
Для определения общего состояния организма при И-Р поражении тонкого кишечника был проведен биохимический анализ крови, который включал в себя измерение активности печеночных ферментов – аланинаминотрасферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ). Биохимический анализ проводили на биохимическом экспресс-анализаторе Reflotron Plus («Roche Diagnostics», Швейцария.) в соответствии с рекомендациями производителя. В качестве биологического материала использовали сыворотку крови. Полученный биологический материал (30 мкл) помещали на специализированные тест-полоски с соответствующей маркировкой (Тест-полоски GOT (AST – aspartate aminotransferase) Reflotron, Тест-полоски GPT (ALT – alanine aminotranfrerase), Reflotron, «Roche», Германия).
В тонкой кишке и мезентеральных сосудах проводили анализ экспрессии генов для 15-ти основных ферментов-антиоксидантов: глутатионпероксидаз (GPx1, 2, 3, 7, 8); пероксиредоксинов (Prx1-6); супероксиддисмутаз (SOD1-3) и каталазы. Также исследовали уровень экспрессии генов для ядерного фактора kappa B (NF-kB), фактора некроза опухолей – a (TNF-a), маркера апоптоза caspase-3 и клеточного маркера пролиферации Ki67. Только в мезентеральных сосудах исследовали уровень экспрессии генов для трех изоформ синтазы оксида азота: нейрональной (nNOS), эндотелиальной (еNOS) и макрофагальной (индуцибельную) (iNOS).
В качестве праймеров использовали ген-специфические праймеры, синтезированные согласно их последовательностям в GenBank. Уровень экспрессии генов определяли методом ОТ - ПЦР (обратная транскрипция + полимеразно-цепная реакция) в реальном времени. Общую РНК из образцов ткани получали с помощью реактива ExtractRNA («Евроген», Россия). Качество РНК оценивали электрофоретически в 2% агарозном геле в ТАЕ буфере, в присутствии бромистого этидия (1 мкг/мл). Концентрацию РНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000c (США). Для обратной транскрипции использовали 2 мкг общей РНК для каждого эксперимента, обратную траскриптазу MMLV («Евроген», РФ) и стандартный праймер олиго-dT15.. Полученную в результате обратной транскрипции кДНК, использовали для ПЦР с ген -специфическими праймерами («Евроген», Россия). ПЦР в реальном времени проводили в амплификаторе BioRad iQ5 («BioRad» США) c использованием Taq ДНК-полимеразы HS («Евроген», Россия), в качестве флуоресцентного интеркалирующего красителя использовали SYBR Green II («BioDye», Россия). Режим ПЦР: (1) «горячий старт» (для исключения неспецифичного отжига праймеров) при t = 95С 5 мин, (2) денатурация при t = 95С 15 с, (3) отжиг праймеров при t = 60С 20 с, (4) синтез ДНК при t = 72С, 20 с. Этапы 2–4 повторяли 40 раз. Определение значений порогового цикла - Ct (threshold cycle) проводили с помощью программного обеспечения BioRad (США). Нормирование проводили относительно генов «домашнего хозяйства»: гена фактора элонгации EF1a или гена бета актина Actb. Расчеты Сt проводили по формуле Сt = Сt (контроль) - Сt (опыт), каждое значение Сt рассчитывали по формуле Сt = Сt (исследуемый ген) - Сt (референтный ген Actb или EF-1a) [Schmittgen T.D. et al., 2008].
Состояние тонкого кишечника при И-Р поражении
Таким образом, влияние экзогенного Ргхб на состояние сосудов брыжейки при И-Р выражается в снижении поражения клеток эндотелия и в сохранении механизмов, регулирующих просвет сосудов, что обусловлено увеличением уровня экспрессии генов для NO-синтаз (в первую очередь для iNOS) и изменением метаболизма оксида азота.
Полученные данные свидетельствуют, что экзогенный Prx6 оказывает протекторный эффект на все звенья, включенные в И-Р поражение: тонкий кишечник, МЦР и мезентеральные сосуды. Протекторный эффект Ргхб определяется его пероксидазной активностью. С началом реперфузии происходит поражение апикальной части ворсинок, что коррелирует со снижением ПМ в этот период, однако к концу реперфузии Ргхб опосредует восстановление уровня перфузии кровью кишечной ткани, что связано с минимизацией поражения МЦР и слизистой оболочки тонкого кишечника. Восстановление ПМ к концу реперфузионного периода проявляется на фоне сохранения слизистой оболочки во всем кишечнике. Влияние Ргхб на состояние сосудов брыжейки при И-Р выражается в снижении поражения эндотелия сосудов и сохранении миогенного тонуса на фоне усиления экспрессии генов NO-синтаз и изменения метаболизма N0. 2.3. Влияние экзогенного пероксиредоксина 6 на уровень экспрессии маркерных генов при И-Р поражении
Было показано, что применение экзогенного Ргхб снижает степень реперфузионного поражения кишечной и сосудистой тканей. Можно предположить, что в основе этого феномена лежат процессы, имеющие общий механизм. Для проверки этого предположения было исследовано влияние экзогенного Ргхб на генетический профиль ткани кишечника и мезентеральных сосудов при И-Р поражении.
Для решения поставленой задачи был исследован уровень экспрессии генов для NF-kB, TNF-a, caspase-З, КІ67 при И-Р в условиях применения пероксиредоксина 6 в кишечной ткани и мезентеральных сосудах.
На рис. 42 представлены данные по влиянию экзогенного Ргхб на изменение уровня экспрессии генов при И-Р поражении в кишечной ткани. Стоит обратить внимание, что И-Р поражение приводит к активации экспрессии генов для caspase-3 (в 3,2 раз) и снижению экспрессии генов для фактора пролиферации Ki67 (в 6,25 раз) по сравнению с контролем. В условиях введения Ргхб наблюдается противоположная ситуация. На рис. 42 видно снижение уровня экспрессии гена для caspase-3 относительно контрольного И-Р поражения (в 1,8 раз, p 0.05), что указывает на снижение апоптотической гибели клеток, и, напротив, повышение экспрессии генов для Ki67 (в 7,8 раз, p 0.05), что указывает на сохранение регенеративных резервов кишечной ткани от поражения.
Изменение экспрессии генов для TNF - а и NF-kB проявлялось в снижении уровня их экспрессии (в 2,5 раз и 4 раза, соответственно) относительно контроля и достоверно не изменялось при использовании пероксиредоксина 6 (р 0,05). Рис. 42. Влияние экзогенного Prx6 на изменение уровня экспрессии генов для факторов, ответственных за гибель и пролиферацию клеток кишечника при И-Р.
Данные рассчитаны относительно контроля ± SE (стандартная ошибка). N=10. Контроль принят за единицу
Аналогичное исследование по влиянию экзогенного Ргхб на изменение уровня экспрессии генов для факторов, ответственных за гибель и пролиферацию клеток при И-Р, было проведено для мезентеральных сосудов (рис. 43). В контрольном И-Р поражении через 120 мин реперфузии в мезентеральных сосудах наблюдается активация экспрессии генов для ядерного транскрипционного фактора NF-kB (в 2,3 раз), caspase-3 (в 3,2 раз) и фактора пролиферации Ki67 (в 2,5 раз) относительно контроля (р 0.05). Применение Ргхб изменяет картину экспрессии данных генов по сравнению с контрольным поражением. В частности, происходит увеличение экспрессии генов для NF-kB (в 2,7 раз) и Ki67 (в 1,3 раза), и, напротив, происходит снижение уровня экспрессии генов для caspase-3 (в 2 раза). Такая картина указывает на уменьшение апоптотической гибели клеток и активации репарационных процессов в сосудах брыжейки. И-Р поражение приводит к достоверному изменению экспрессии генов для всех представленных факторов относительно контрольного И-Р поражения (р 0.05). Рис. 43. Влияние экзогенного Prx6 на изменение уровня экспрессии генов для факторов, ответственных за гибель и пролиферацию клеток мезентеральных сосудов при И-Р.
Данные рассчитаны относительно контроля ± SE (стандартная ошибка). N=10. Контроль принят за единицу
Таким образом, в условиях применения Ргхб при И-Р происходит снижение поражения тканей. В основе этого феномена лежат общие процессы, которые связаны со снижением уровня экспрессии генов, ответственных за апоптотическую гибель клеток, что выражается в сохранении структуры как кишечной, так и сосудистой ткани. На этом фоне происходит повышение регенеративной способности исследуемых тканей. Снижение поражения тканей коррелирует с увеличением экспрессии генов для NF-kB в мезентеральных сосудах. Данные аспекты указывают на протекторную роль Prx6 в сохранении ткани от И-Р поражения.
Было показано, что при И-Р организм активирует собственную антиоксидантную систему для защиты клеток от гиперпродукции АФК, однако этого недостаточно, поэтому наблюдается поражение тканей. Исходя из этого, было исследовано влияние экзогенного Prx6, как дополнительного антиоксиданта, на состояние антиоксидантной системы ткани кишечника и сосудов при И-Р поражении.
Для решения поставленной задачи методом ОТ-ПЦР был определен уровень экспрессии генов для ферментов-антиоксидантов собственной антиоксидантной системы кишечника и мезентеральных сосудов.
На рис. 44 представлено влияние экзогенного Prx6 на изменение генетического профиля антиоксидантный системы в кишечной ткани при И-Р. Среди генов 15-антиоксидантных ферментов, нами исследуемых, наиболее выраженное увеличение экспрессии генов наблюдается для Prx6 (в 1,8 раз), GPx2 (в 2,11 раз), GPx7 (в 3,25 раз), SOD 1 (в 2,2 раз), SOD 3 (в 4,7 раз) (р 0.05 относительно контроля), что говорит об их ведущей роли в борьбе с гиперпродукцией АФК при И-Р поражении. Применение экзогенного Prx6 нормализует ситуацию с экспрессией генов ферментов - антиоксидантов и снижает уровень их экспрессии в сторону контрольных значений. По сравнению с контрольным И-Р поражением снижение уровня экспрессии генов составляет: для Prx6 в 1,6 раз, для GPx2 в 3,7 раз, для GPx7 в 4 раза, для SOD3 в 2 раза и для SOD1 в 1,4 раз (р 0.05). Снижение уровня экспрессии генов ферментов-антиоксидантов, по-видимому, свидетельствует об уменьшении гиперпродукции АФК в кишечной ткани.
Данные рассчитаны относительно контроля ± SE (стандартная ошибка). N=10. Контроль принят за единицу. В сосудах брыжейки также было проведено исследование по влиянию экогенного Prx6 на состояние антиоксидантного статуса при И-Р поражении. На рис. 45 представлены данные по экспрессии генов ферментов-антиоксидантов в мезентеральных сосудах при ИР поражении. В контрольном И-Р поражении уровень экспрессии генов возрастал для следущих ферментов-антиоксидантов: Prx6 (в 2,6 раз), GPx1 (в 3,7 раз), GPx3 (в 3 раза), SOD2 (в 9 раз) и SOD3 (в 3 раза) (р 0.05 относительно контроля), что предполагает их ведущую роль в борьбе с гиперпродукцией АФК в сосудах брыжейки. Введение Prx6 изменяет картину уровня экспрессии генов для GPx1 и GPx3 в сторону снижения уровня их экспрессии по сравнению с контрольным поражением (в 4,5 раз и 1,7 раз, соответственно). С другой стороны, уровень экспрессии остальных генов достоверно не изменяется по сравнению с контрольным поражением.