Исследование иммуноглобулинов в норме и при патологии с помощью моноклональных антител и спектральных методов Ефетов, Константин Александрович

Введение к работе

Актуальность проблемы. Антитела-иммуноглобулины представляют собой ключевые макромолекулы иммунной системы, так как отвечают за распознавание чужеродных агентов и запускают иммунные реакции организма. При патологии может возникать постсинтетическая модификация белков, приводящая к нарушению нормальной функции этих молекул (Троицкий, 1991j. Если такие изменения затрагивают антитела, это вдвойне опасно, так как может привести к сбою работы всей защитной системы организма. Поэтому исследование модифицированных при патологии иммуноглобулинов имеет первостепенное значение для понимания патогенеза многих болезней. С другой стороны, актуально изучение молекулярных механизмов функционирования иммуноглобулинов. Последние являются сложными образованиями, имеющими большую молекулярную массу, доменную структуру, несколько активных центроЕ (антигенсЕязывающих и эффекторных), расположенных в разных частях молекулы. В иммуноглобулинах могут происходить разнообразные информационные переходы, они способны к взаимодействию с различными лигандами не антигенной природы (Dudlch et al., 1983; Завьялов, 1984; Троицкий и др., 1991). Поэтому очевидно, что функционирование антител в иммунной системе не определяется простой агрегацией их на антигене. Безусловно, " важное значение для включения эффекторных функций имеют конформационные перестройки, которые обнаружены в молекулах антител при связывании антигенов и гаптенов ( Burton, 1985).

В настоящее время широчайшее распространение получила гибри-домная технология, открытая менее двух десятилетий тому назад (Kohler, Milstein, 1975). Моноклональные антитела (МКА) к заданным антигенам, продуцируемые гибридомами, являются тонким инструментом для различных молекулярных исследований. Каждое МКА уникально по своим свойствам. Получение МКА к различным антигенным детерминантам иммуноглобулинов человека и других'белков, способных с ними взаимодействовать, является актуальной научной задачей, так как с одной стороны, такие МКА позволяют исследовать свойства (строение, модификацию, функции) иммуноглобулинов, а с другой - они могут пайти применение во многих фундаментальных и прикладных исследованиях (получение аффинных сорбентов, использование в качестве компонентов тест-систем, разработка лечебных препаратов и т. п.), что существенно расширяет рамки значимости таких исследований.

- 2 -'

Все выпесказанное подтверждает актуальность данной работы, посвященной вопросам функционирования иммуноглобулинов человека, изучения модификации их при патологии и получения и испольБОвакия моноклональных антител.

Цель и еадачи исследования. Настоящая работа является продолжением многолетних исследований, проводимых на кафедре биохимии и е лаборатории биотехнологии Крымского медицинского института, которые были начаты под руководством члена-корреспондента АН Украины Г.Б.Троицкого и посвящены изучению физико-химических характеристик иммуноглобулинов и их. изменчивости при патолопш.

Ранее нами (Ефетов и др., 1985) был разработан способ, позволяющий еыявлять изменённые при патолопш иммуноглобулины, оценивая степень устойчивости их конформации к воздействию низких концентраций мочевины (12%) методом температурно-пертурбационной дифференциальной спектрофотометра (ТПДС). При этом выраженные изменения Ig-G были обнаружены при хроническом лимфолейкозе. Было высказано предположение, что возможной причиной изменения IgG при патологии является их неспецифическое связывание с продуктами распада опухолевой ткани. Однако оставался нерешенным ряд вопросов. Является ли 'отмеченная модификация IgG характерной только для лт-фопролифератизных габолеванші или она может возникать и при других новообразованиях? Связаны ли обнаруженные изменения IgG с деструкцией клеток и тканей организма при патолопш? Что является непосредственной причиной данной модификации IgG? Сопряжены ли обнаруженные особенности конформации измененных иммуноглобулинов с нарушением их функций? Для ответа на эти вопросы был значительно расиирен круг изучаемых патологий, увеличен спектр применяемых методов,' получены и использованы моноклинальные антитела.'

Рель данного исследования - изучить изменения конформацион-ного и функционального состояния иммуноглобулинов G при патологии к выяснить биохимические основы этих изменений.

Для достижения намеченной цели поставлены и решены сдедукицке задачи:

1. Получить на осноеє гибридомной технологии моноклональные антитела к иммуноглобулинам человека, а также к ачфифильноыу пептиду из яда пчелы - мелиттину, с целью изучения его взаимодействия (как модельного лиганда) с IgG человека. Использовать полученные ыоноклональные антитела для исследования иммуноглобулинов

- з -при патологии.

1. Исследовать в сравнительном аспекте устойчивость нснфор-мацин нммуноглобулшов В в норме, при злокачественны:; новообразованиях различны; локализаций и другие патологических состояниях, сопровождаидихся деструктивными процессами в организме.

2. Изучить способность IgG к агрегации в норме и при патологии.

3. Изучить взаимодействие амфифильных соединений (липидов, пептидов) с IgG человека и проанализировать локализацию возможных центроз связывания на молекуле иммуноглобулина.

4. Определить содержание липидов з препаратах IgG в норме и при патологии.

5. На модельной паре моноклональное антитело - антиген исследовать влияние амфифильных соединений на антигенсвязываюшую функции IgG.

6. Оценить комплементфиксирущух) способность IgG, измененных при изучаемых заболеваниях.

7. Выяснить причины модификации IgG при патологии.

8. Исследовать возможность появления парапротеикемии при злокачественных новообразованиях недимфоидного происхождения.

Научная новизна. Впервые обнаружена повышенная устойчивость IgG, выделенных ;:з сыворотки крови людей, больных злокачественными новообразованиями желудка и других локализаций, к воздействии 12Х мочевины по сравнении с IgG здоровых людей. Зти изменения связаны с деструктивными процессами в организме, что подтверждается увеличением "жёсткости" конформации IgG при патологии, сопровождающейся разрушением клеток и тканей организма (острое отравление уксусной кислотой с выраженным гемолизом, ревматизм, ревматоидный артрит, бронхоэктатическая болезнь)..

Впервые показано, что IgG при злокачественной опухоли желудка обладают повышенной склонностью к агрегации по сравнению с IgG здорового человека.

Впервые удалось смоделировать условия, при которых IgG, выделенный из сыворотки крови здорового человека, приобретет повы-пенкую устойчивость конформации, характерную для IgG при патологии. Это достигалось присутствием в растворе фосфатидилхолнна или мелиттина вместе с IgG здорового человека в молярном соотношении 5:1. С помощью моноклональных антител к мелиттину показано, что этот пептид связывается с IgG в молярном соотношении 1:1, причём

- 4 -основным местом связывания является Fc-фрагмент. Так как эффект 127. мочевины на IgG локализован по данным ТПДС преимущественно в Fab-фрагментах, но значительно снижается при связывании лпганда Fc-фрагментом, сделан вывод сб увеличении устойчивости кокформа-ции Fab-области в результате взаимодействия Fc-фрагмента с амфи-фильными лигандами.

Обнаружено, что константа диссоциации комплекса IgG-Clq для некоторых IgG при злокачественных новообразованиях различных локализаций выше, чем для іечЗ здоровых людей.

Показано, что взаимодействие амфифилькых лигандов (фосфати-дилхолина, мелиттина) с IgG-антнтелами прнЕодпт к ослабленню ан-тигенсвязывашей активности антител.

Впервые делается вывод о том, что обнаруженная модификация IgQ при патологии (повышенная устойчивость к воздействии мочевины. склонность к агрегации) является следствием ЕгаимодейстЕия Fc-фрагмента IgQ с амфифильными продуктами распада клеток и тканей организма. Это приводит к нарушению функции иммуноглобулинов (ослабление комплементфиксирующёй и антигенсвлзывающей активности) , что может быть причиной ослабления гуморального ' иммунитета при изучаемой патологии.

Получено 12 новых штаммов гибридом, продуцирующих монокло- нальные антитела к IgQ, IgM человека, их тяжелым и лёгкш цепям и протеолитическш фрагментам. Часть из этих антител обнаруживает способность к преципитации антигена, что позволяет их использовать для качественного и количественного определения иммуноглобулинов в методах иммунодиффузии. Получен также клон гибридомных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к пептиду из яда пчелы - мелиттину.

Создан аффинный сорбент на основе полученных мсноклонзльных антител к IgGl,2,3, с помощью которого выделен парапротеин IgS4 при физиологических значениях .рН и ионной силы растЕора.

Практическая ценность. Полученные данные о модификации иммуноглобулинов G при патологии (повышенная устойчивость конформа-ции, склонность к агрегации, ослабление ксшлементфикеирующей активности) имеют Еажное значение для понимания молекулярных механизмов патогенеза заболеваний.

Полученные в работе моноклональные антитела могут быть применены для различных биохимических, иммунологических, клинических исследований, создания диагностических тест-систем и лечебных пре-

- 5 -паратон. Продемонстрирована возможность использования USA для количественного определения уровня иммуноглобулинов, диагностики пз-ралрстекнемий, изучения взаимодействия дигандсв с иммуноглобулинами.

Имеются положительные решения патентной экспертизы о выдаче 12 патентов на изобретения.

Исследования проводились в рамках ряда государственных прог-рамм:

1. Программы ГКНТ и АН СССР 0.74.05 по физико-химической биологии и биотехнологии, по заданию 17.Н2 "Исследование мехмолеку-лярных взаимодействии в иммунной системе в норме и при патологии",

2. Государственной научно-технической программы 01.04.00 "Исследование механизмов формирования противоопухолевой резистентности организма и разработка способов его усиления", по заданию Государственного комитета Украины г.о гол росам науки и технологий "Выяснение механизмов пс-етсинтетической модификации иммуноглобулинов чєлоеєкз при злокачественных новообразованиях"

3. Научного направления 5 "Науки с Земле: проблемы окружающей среды", з соответствии с заданием 5/221 Государственного комитета Украины по вопросам науки и технологий "Получение монокло-налькых антител и использование их как иммунодиагностикумов при патологии и а экологически неблагоприятных условиях".

Апробация работы и внедрение. Материалы диссертации были доложены на 15-й Конференции Федерации европейских биохимических обвдстЕ (Москвз, 1984), 4-м симпозиуме СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей кл-тке" (Киев, 1984), 5-й, 6-й и 7-й Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимере з -'Харьков, 1934, 1983, 1991), Республиканской конференции "Механизмы иммуностимуляции" (Киев, 1985), 2-м Украинском съезде гематологов и трансфузиолсгов (Киев, 1985), Международных симпозиумах "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы (Путино, 1987; "Краков, 1S89), 1-й Всероссийской конферен-;:- "Система комплемента" (Киров, 1967), Всесоюзной конференции "Бис/.учия - медицине" (Ленинград, 1988), 5-м и 6-м Украинских биохимических съездах (Ивано-Франковск, 1987; Киев, 1S92), на заседаниях Крымского отделения Украинского биохимического общества и научных конференциях кафедры биохимии Крымского медицинского института (Симферополь).

Полученные моксклональные антитела к мелиттину были внедрены

в Институте биохимии им. А.В.Палладина АН Украины (акт внедрения от 17.03.93), где они были использованы для изучения взаимодействия этого пептида с липидами в модельных мембранах. С их помощью была установлена локализация антигенных детерминант мелнттина в мембране, что позволило исследовать механизм биологического действия пептида (Костржевская и др., 1992).

Публикации. Основные результаты исследований были опубликованы е 39 печатных работах, включая 12 патентов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 267 страницах машинописного текста, включая 22 таблицы и 28 рисунков. Работа состоит ив введения, семи глав, заключения и выводов. Список литературы содержит 393 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.