Введение к работе
Актуальность проблемы. Микросомная монооксигеназная система подвергает биотрансформации с последующим выведением из организма многочисленные, разнообразные по химической структуре и биологической активности Ееществз. В многообразии индукторов (химических соединений, приводящих к синтезу de novo ферментов моно-окскгеназной системы) можно выделить две группы, отличающиеся специфичным индуцирующим действием,: ксенобиотики ФБ-типа, приводящие к биосинтезу в основном цитохрома P450IIB1, и ксенобиотики МХ-типа, индуцирующие цитохрома Р4501А1 и Р4501А2 (Thomas et al., 1983).
В настоящее время достаточно полно изучено влияние основных представителей этих двух групп ксенобиотиков на биосинтез ряда форм цитохрома Р-450 и на их биохимические параметры ~а ми-кросомной фракции печени (Ляхоеич, Цырлов, 1981; Мишин, Ляхо-еич,1985).
Однако, в последнее время появились основания считать, что получаемые результаты не отражают в полной мере ситуацию, имеющую место е клетках. Это может быть связано с высвобождением лизосомалышх ферментов в процессе гомогенизации ткани печени, с нарушением возможности проникновения субстратов' через лшшдный матрикс мембран эндоплазматического ретикулума и процессов образования фермент-субстратных комплексов, с нарушением транспорта электронов от NADPH к цитохрому Р-450 (Лукьянова и др., 1985). Более того, возможность изошіотностногс фракционирования свежеизолированных гепвтоцитов позволяет исследовать распределение изоформ цитохрома Р-450 в различных субпопуляциях печеночных клеток.
С другой стороны, противоречивость существующих данных по анализу биохимических параметров в субпопуляциях гепатоцитов, полученных методом изоплотностного фракционирования, могла быть прояснена с помощью иммуногистохимических исследований распределения ферментов в дольке печени крыс.
Отсутствие комплексных биохимических, иммунохимических и иммуногистохимических исследований распределения содержания и
активности изоформ цитохрома Р-4БО служит серьезным препятствием для правильного понимания функционирования монооксигевазной системы на клеточном и органном уровнях, а также возможности применения полученных результатов в области фармакологии и медицины.
Цель работа. Комплексное исследование на крысах индукции шкросомных монооксигеназ: I) на субклеточном уровне (микросомы), 2) на клеточном уровне (изолированные гепатоцитк) и 3) на органном уровне (долька печени).
Предметом исследований были молекулярные формы цитохрома Р-450: Р450ІІВ1 - основная, индуцируемая ксенобиотиками ФБ-типа, и Р450ІА1 - основная индуцируемая ксенобиотиками МХ-типа.
Задачи исследования:
-
Оценить содержание и активность форм цитохрома Р-450 в микросомах крыс, получавшим Ж и MX го разным схемам.
-
Исследовать распределение содержания и активности цитохрокз Р-450 в субпопуляциях гепатоцитов крыс в моделях раздельной и совместной индукций индукторами ФБ- и МХ-типа.
-
Выявить локализацию и динамику распределения индуцированных изоформ цитохрома P450IIB1(+Б2) и P450IA1 в дольке печени крыс.
-
Исследовать влияние часйгчной гепатэктомии на распределение форм цитохрома Р-450 в дольке печени крыс.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование распределения форм монооксигеназ P450IA1 и P450IIB1(+В2) в дольке печени крнс. В работе была использована модель одновременного введения Ш и Ш для выявления распределения содержания и активностей форм цитохрома Р-450 в субпопуляциях гепатоци-тов, полученных методом изошютностного центрифугирования в градиенте фиколла. Также впервые была исследоЕзна локализация' форм P450IA1 и P450IIB1(+В2) в дольке печени крыс в модели смешанной индукции ксенобиотиками ФБ- и МХ-типа, а также в печени, гепатэктомировашшх крыс, получавших либо ФБ, либо MX.
Практическая значимость. Работз представляет собой комплексное исследование распределения содержания и активностей форм цитохрома Р-450 на субклеточном, клеточном и органном уровнях в динамике индуцирующего действия ксенобиотиков ФБ- и
ЮС-типа и носит преимущественно теоретический характер. Однако, теоретические посылки могут быть использованы для дальнейшего внедрения в области медицины. Тан, например, установленное в работе перераспределение формы Р450Ш в перипортальную зону дольки печени крыс, получавших'совместно ЗЕ и MX, может Сыть использовано для направленного, избирательного ингибирования этой формы в печени. Это очень важно в связи с тем, что именно эта форма катализирует метаболическую активацию канцерогенов типа полициклических ароматических углеводородов и ароматических аминов (Pelkonen, Nebert, 1982).
Работа выполнена в рамках Всесоюзной программы "Гидроксилаза" в соответствии с плановой темой, утвержденной Государственным комитетом по науке и технике (№ государственной регистрации 79040821).*
Основные положения, выдвигаемые на защиту:
-
Введение фенобарбитала приводит к выявлению наибольшего содержания формы Р450ПВ1(+В2) и активности бензфетамин-ІІ-деме-гапазы в легких фракциях гепатоцитов, а введение 3-метилхолант-ренз и р-нзфтофлзЕонз - к равномерному распределению содержания формы F450IA1 и активности бензпирен-гидроксилазы в субпопуляциях клеток, что соответствует результатам иммуногистохимичес-ких исследований распределения форм в дольке печени крыс.
-
В модели совместного введения фенобарбитала и.р-нафто-флаЕона распределение форм цитохрома Р-450 и специфичных для этих форм активностей в субпопуляциях клеток не 'соответствует картине распределения форм цитохрома Р-450, определяемых имму-нохимически.
-
Частичная гепатэктомия приводит к повышению монооксиге-назной активности в печени крыс после введения фенобарбитала и 3-метилхолантрена.
Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзных конференциях "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды" (Новосибирск, 1987), "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1989), МеадунвродеиЗконференции "Системы метаболизма лекарств" (София, 1986), Гепатологи--ческом симпозиуме (Мена, 1988), 6 Мехи:- конф. по биохимии и биофизике цитохрома Р-450 (Вена, 1988),т1 Мевд. конф. по фер-
ментным системам метаболизма лекарств (Варна, I9S9), 9 Мезд. конф. ДИОКСИН-89 (Торонто, 1989), 3 Евр. конф. по метаболизму чужеродных соединений (Лондон, 1989).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Объеи и структура диссертации. Диссертация изложена нз 132 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 15 рисунков ж состоит из введения, обзора литературы, описания собственных исследовании, включающего материала и метода, результаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы из 236 источников.