Введение к работе
Актуальность темы. Мембранные аденозинтрмфосфатазы <АТФазы> являются клшчевыми Ферментами энергетического метаболизма всех живых кпвток. В последние десятилетия в лабораториях всего мира активно изучаются структура, биохимические свойства и механизм действия различных АТФаз. Изучение бактериальных АТФаз представляет особый интерес. Относительная простота организации прокариотических клеток с одной стороны, и исключительное разнообразие их физиологии с другой представляют .широкие возможности для изучения основных закономерностей строения, и функционирования Ферментов энергетического метаболизма.
Иембранныа АТФазы осуществляют взаимное превращение дву;< основных Форм энергии в живых клетках - энергии макрозргической связи А?Ф и трансмембранного электрохимического градирита ионов. D большинстве клеток энергетические потребности обеспечиваются трансмембранным градиентом протонов U/ЛҐ") . В.П. Скулачев предположил, что бактерии, обитагацие в цепочной среде при повышенной концентрации солей, например Vibrio alginalyticus могут иметь энергетику иного типа: в этом случае место амп занимает трансмембранный градиент ионов натрия (АдЫа ) (Скулачев, 1985) '.
У Vibrio alginolyticus обнаружен генератор йуЫа в дыхательной цепи - Ыа --транспортирукщая МАСН:;;инон-редуктаза [Totcuda and Unemota., 19S2). Д^ЙЗ используется для транспорта субстратов в клетки tTokada et al.jlVRZ] и обеспечивает движение Бактерий (Dibrov et ai.,i?S4). Как показано в нашей лаборатории, синтез АТФ В СЕЧ Vibrio alginolyticus может .происходить при
создании искусственного трансмембранного градиента концентрации На , причем этот процесс устойчив к действию; протонного разобщителя и подавляется натриевым ионофором моненсином [Dibrov et «1,19833. Однако в мембранным препаратах Vibrio alginolyticus был обнаружен АТФ-зависимый транспорт протона ISmimova et al 1988!
Целью данной работы являлось изучение транспортной специфичности АТФазы Vibrio alginolyticus. Для этого определены кинетические параметры взаимодействия АТФазы и некоторым им. ибиторов F0 канала, выделен и очищен FqFj-комппєкс, встроен в липосомы и измерен АТР-зависимый транспорт протонов и ионов натрия
Научная новизна работы. В ходе работы впервые выделен и очищен F0F -комплекс из vibrio alginolyticus. По данным электрофореза он содержит субъединицы с молекулярной массой 58, 55, 38, 25, 23, 17 и 14 кДа. Дополнены данные по ингибиторному анализу Фермента.
Показано, что протеолипосомы, содержание 'F-F.-АТФазу из Vibrio alginolyticus способны накапливать протон в процессе гидролиза АТР, процесс чувствителен к ингибиторам F канала (ECCD, вентурицидин , тРифениполово), эффект снимается протонными разобцителями. Тот же препарат протеолипосом не накапливал Ыа .
Практическое значение работы. Полученные результаты дают новую информацию о фермента» энергетического метаболизма бактерий и могут быть использованы при дальнейших исследованиях в области биоэнергетики. Они подтверждают универсальные принципы организации АТФаз различных организмов. Разработанная методика поручения F.F,-комппекса из Vibrio ~1яіrwlyticus не трудоемка и отличается простотой, чта позволяет использовать Фермент в качестве дешевой модели дпч исследований механизма синтеза АТР и АТР-зависимогс
транспорта протонов.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на теоретическом семинаре лаборатории биоэнергетики НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского ИГУ им. И.В. Ломоносова.(Москва, 1989, 1990, 1991).
Публикации. По материалам исследований опубликовано 3 работы.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы в двух главам, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация иллюстрирована 3 таблицами и 23 рисунками.