Введение к работе
Актуальность проблеми. Для понимания тонких механизмов деятельности головного мозга млекопитающих, включая мозг человека, необходимо дальнейшее изучение метаболических процессов, лежащих в основе проведения высокоскоростных сигналов в ДОС (Бехтерева, 1980, І987). В настоящее время многие особенности метаболизма нейронов и превращений нейромедиаторов в синапсах изучены достаточно полно. Вместе с тем, при детальном анализе функций нейронов оказывается, что большинство неизученных вопросов, касающихся механизмов высокоскоростной передачи сигналов, связаны с необходимостью углубленного исследования молекулярной организации нейрональной мембраны, природы и свойств ее важных структурных компонентов - рецепторов для нейромедиаторов (Дамбинова, IS83, 1986; Сергеев, Шимановский, 1986).
В последние годы в качестве одного из основных возбужда
ющих нейронедиаторов головного мозга предлагается L-глутамат
( Snyder, 1981; ?oeter, Pagg, 198. Были представлены дока
зательства существования глутаматных рецепторов на мембранах
нейронов ( Curtis, Watklns, I960; Watklns, Evans ,. 1981; Mono-
gham, cotman, 1986; Крышталь и др., 1984, 1986). Интерес
к этому типу рецепторов резко возрос после появления работ, касающихся широкой распространенности глутанатергических путей в разных структурах головного мозга: нервных клетках зрительной и моторной зоны коры больших полушария, нейронах гип-покампа, гипоталамуса, мозжечка и полосатого тела и др.СРошшш, 1983, 1984). Зто обстоятельство позволяет предполагать, что глутаматные рецепторы принимают участие в осуществлении высших функций мозга человека, например, в развитии мыслительных процессов и в механизмах памяти ( Bawdry, lynch, 1984) - Кроме того, для клинической неврологии имеют значение сведения о связи нарушения функции глутаматных рецепторов и распростране-н:;л гипервозбуждения в ряде подкорковых структур мозга, в частности, при эпилепсии ( Kelirum, I960, 1984; Bradford, Peterson, 1986; Раевский, Георгиев, 1986). В связи со сказанным становится понятной актуальность изучения глутаматных рецепторов как для оЗ'цетеоретическкх проблем нейробиологии, например, эволюция хеморецепц;:и, так и для практической медицины, с
_ Ц -
целью выработки оптимальных фармакологических средств, воздействующих избирательно на глутаматергические системы мозга, пораженные при эпилепсии.
Глутаматные рецепторы ЦНС изучены значительно меньше, чем рецепторы других нейромедиаторов головного мозга. В большей степени это касается молекулярной природы и функциональной организации рецепторов глутамата. Практически не изучены их физико-химические свойства, пространственная организация и функции рецепторов глутамата в разных модальных системах, например, протеолилосомах.
Вместе с тем очевидно, что решение этих задач не будет полным без изучения структуры и функции изолированных препаратов глутаматных рецепторов. Несмотря на то, что анализ молекулярных свойств очищенных глутаматных рецепторов имеет ряд трудностей методического характера, тем не менее существует возможность изучения функции этих рецепторов в разных модельных системах с помощью биохимических подходов. Исследование функции указанных рецепторних макромолекул путем реконструкции их в замкнутые искусственные фосфолилидные мембраны - липосомы и/или плоские бислои позволяет получить данные о молекулярной организации хеморецелторного комплекса, отражающие его функцию "в чистом виде". С практической точки зрения, исследования функции глутаматных рецепторов в протеолмпосомах могут найти применение для направленного транспорта лекарственных препаратов в головной мозг млекопитающих.
Исследования глутаматных рецепторов в Отделе иеґірофизио-логии человека НИИЭМ АМН СССР проводятся в рамках программы "Фундаментальные науки - медицине" по разделу 02.11.08 (изучение механизмов функционирования хеморецептивных мембран) и "Мозг" по разделу 4.1.3 (физиолого-биохимические основы устойчивых патологических состояний ЦНС).
Цели и задачи исследования.
Основной целью работы является изучение физико-химических свойств глутаматсзязывающих мембранных белков головного мозга крыс и исследование их функции в протеолилосомах.
Были поставлены следующие задачи:
I. Выделить и очистить препараты глутаматсвязывающих мембранных белков из синаптических мембран коры больших полушарий головного мозга крыс.
-
Провести анализ физико-химических овойств очищенных препаратов глутаматсвязываюцих мембранных белков.
-
Исследовать кинетику транспорта катионов на+, ^Са"*"1" и Rb+ в протеолипосомах, содержащих встроенные глутаматсвя-; зывающие мембранные белки.
-
Изучить возможность направленного транспорта протеоли-посом в головной нозг крнс линии Крушинского-Молодкиной.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Солюбилизированный и счищенный препарат глутаматсвязы-вавдих мембранных белков представляет собой гликопротеид-липид-ный комплекс, состоящий из нескольких субъединиц с молекулярной массой І4 кД и соответствует по своим кинетическим параметрам связывания физиологическому рецептору глутамата.
-
Наиболее устойчивей информацией препарата глутамат-связывакгаих мембранных белков является тетрамер с молекулярной массой 52-60 кД , который под воздействием нейромедиатора может ассоциировать в более высокомолекулярные компоненты.
-
Моделирование ионофорной функции глутаматных рецепторов головного мозга свидетельствует об избирательном накоплении ионов, Яа+ в протеолипосомах, содержащих встроенные глута-матсвяэываадие мембранные белки.
-
Разработана экспериментальные подходы к направленному транспорту лекарственных препаратов, инкапсулированных в про-теолипосомы, в головной мозг крыс линии Крушинского-Молодкиной, обладавших генетической склонностью к аудиогенным судорогам.
Научная новизна и теоретическое значение работы.
Выполненное исследование является одним из первых, проводимых у нас s стране и за рубежом, посвященных изучению молекулярной природы и свойств глутаматных рецепторов головного мозга млекопитающих. Биохимическая характеристика препаратов глутакатсввзывающих мембранных бстпов, изолированных от синап-тически;; мембран, позволяет дополнить факты, касавшиеся меха-ни?мов функционирования одного из наиболее значимих нейроре-цепгороз, которые до сих пор изучаются преимущественно с помощью электрофизиологичесп/." подходов. Впервые продемонстрирована возможность изучения метаболической регуляции ионселектив-ной функции этих белков, реконструированных в протеолипосомы, и их пространственной урбанизации з протеолипосомах с помощью моноклональннх антител к ГЖ. Впервые обнаружено, что выделен-
:6-
ыый и очищенный из яда паука Argicpa lobatв нейротоксин -аргиопин способен не только блокировать ионеелективную функцию глутаматных рецепторов насекомых, но и влиять на рецепторное связывание 1- Н-гвутамата с очищенными фракциями ГМБ мозга крыс. Это свидетельствует об эволюционной близости глутаматных рецепторов у беспозвоночных и позвоночных. Полученные данные дополняют и расширяют общетеоретические представления о ходе зволіти химических факторов переноса информации в разнообразных биологических системах.
Научно-практическое значение полученных результатов.
Полученные результаты могут оказаться полезными для выяснения механизмов патогенеза некоторых заболеваний нервней системы, в частности, эпилепсии и поиска новых антиэпилептических фармакологических препаратов.
Разработанная нами методика реконструирования глутамат-связывающих мембранных белков в липосомы позволяет создать модельную систему, не которой можно изучать избирательное действие разных биологически активних веществ на ионтранспортирую-цую и нейромедиаторузнапцую функции рецептора. Это расширяет возможности скрининга фармакологических препаратов, которые селективно воздействуют на разные этапы глутаматергической передачи и обладают выраженным противосудорожным эффектом.
Данные, полученные в экспериментах с крысами линии Крушин-ского-Молодкиной, у которых имеется наследственная предрасположенность к аудиогенным судорожным припадкам, позволяют сделать вывод о том, что протеолипосоны с инкапсулированными в них лекарственными препаратами могут служить перспективными векторами для направленного транспорта этих препаратов в головной мозг. Протеолипосомы не обладают токсичностью и способствуют пролонгированному терапевтическому эффекту ряда фармакологических средств ентиэпилептического действия, включая пептидные препараты.
Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на совместном заседании Отдела нейрофизиологии человека (рук .отдела - академик Н.П.Бехтерева) и Отдела биохимии (рук.отдела -академик АМН СССР А.Н.Климов) НИИ экспериментальной медицины АМН СССР.
Основные результаты работы доложены на Ш Советско-Шведском симпозиуме по физико-химической биологии (Тбилиси, 1981г),
на 15 конференции ФЕБО (Москва, 1984 г.), на 5 Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, IS86 г.), на 6 Конгрессе Европейского нейрохимического общества ( Прага, 1986 г.).
Публикации . Материалы диссертационной работа отражены в двух отчетах по темам НИР: "Изучение некоторых биохимических характеристик глутаматсвязывавдих рецепторов мембран различных ' структур головного мозга при разных функциональных состояниях", номор гос. регистрации 02830042Є4І (1980-1982) и "Изучение молекулярных, ионофорных и фармакологических свойств глутаматных рецепторов ЦНС", номер гос. регистрации 02860065534 (1982-1985).
Объем и структура диссертации . Диссертация изложена на 142 стр. и состоит из введения, обзора литературы ( главы I, 2), методов исследования ( глава 3), материалов собственных исследований ( главы 4, 5), обсуждения результатов и выводов. Работа иллюстрирована ЗІ рисунками и содержит 7 таблиц. Список литературы представлен 30 отечественными и 124 иностранными ссылками.