Введение к работе
Актуальность темы. В последнее ьоімя яабж^эется тенденция к углубленному научению биохимических процессов в культивируемых клетках растений. Многие культивируемые растительный ткани уяе сейчас является промышленными продуцентами важных биологически активных вецеств : лчзло-идов, гдйкоаидоз, Ферментов к т. д. (Бутенко, 1986), Б связи о чем несомненный практический интерес представляет изучение их метаболизма. Кроме того, при оаботе с культурой ткани имеется уникальная возмолзюеть изучить потенции изолированных клеток, а такте их реакцию на различные вяеигие факторы, не опосредованную другими тканями растения.
Несмотря на довольно интенсивные физиологические и цито-морфологические исследования в культивируемых клетках растений, в настоядае время имеется совсем немного работ по кругообороту белков растения и особенно его связи со вторичным метаболизмом. Шлду тем, происходящие в дифференцированных клетках каллуса изменения метаболизм- белков, а .также их биологической активности» сходства к субстратам и т. д.. могут приводить к модификации ряда биохимических процессов (Кодав, 1981 \ Подобные изменения могут привести к потере клетками способности синтезировать некоторые характерные для ингактного растения соединения или, налротиз, к биосинтезу de novo ранее не обнаруживаемых вторичных "era-болитов. Таким образом, оценка метаболизма культивируемых клеток растений создает определектую т'еоретическу» базу для направленного синтеза вторичных ыатаболитоз, являющихся цеянши лекарственными препаратами.
В Санкт-Петербургском химико-фармацевтическом институте в течение ряда лет ведутся интенсивные работы по изучении биохимических процессов s каллусяых культурах редких лекарственных растений женьшеня и Раувольфии змеиной (Комов и соавт. ,1981-1990).
Протеолиз является одним из клячевых звеньев регуляции клеточного метаболизма (Bollar & Kende. 19?б; МаШе,
- г-
1С82). Протеиназы найдены практически во всех клеточных ор-ганеллах и принимает участие в самых разнообразных процессах (Noble & DalИпг, 1982; Okunuki, 1961; Ottsen. 1967; Ram et aL . 1986). Вместе с тем основной литический потенциал растительной клетки сосредоточен в вакуолях, на долю которых приходится до 80 X протеодитической активности.
В настояли работе сделана попытка оценить вклад протео-лиза е регуляции клеточного метаболизма в каллусной культуре Rauvolfia serpentina
Основные задачи исследования. Е работе были поставлены следующие задачи:
-
оценить обший протеолитический потенідал клеток Rauwolfla serpentina и его распределение по органеллам
-
изучить динамику изменения активности различных про-теиназ в процессе культивирования
-
выделить и очистить до гомогенного состояния вакуляр-ную протеинаэу, охарактеризовать ее физико-химические свойства
-
исследовать параметры кругооборота f-^рмента в корме.. а также влияние на метаболизм протеиназы фитогоршнов (ауксинов и цитокининов).
Научная новизна работы. В настоящей работе впервые был оценен протеолитический потенциал клеток Rauwolfla serpentina, его локализация по органеллам. изучена динамика
ИЗШНеНИЯ ПрОТеоЛИТИЧеСКОЙ аК*"ИВНОСТИ И ВЫЯВЛена ЄЄ : ІЄВИД-
Кс~і коредляция с изменениями биомассы и тотального белка в процессе кульпюироваякл.
Был разработан метод выделения и очистки до гомогенного состояния кислой вакуолярной протеиназы из 35-дневной культуры, определена ее молекулярная масса, проведена оценка субстратной специфичности, изучены другие физико-химические свойства фермента.
В работе і іределенн константы скоростей синтеза и распада протеиназы, ее концентрация и время "полухизни", а также показано влияние на эти показатели ауксинов и цитокининов, предложена интерпретация регуляторного механизма действия этих гормонов, опосредованного вакуолярной протеиназой.
- з -Практическая значимость работы. Работа явл. зтся теоретическим исследованием. Получены данные о физ.-"отхимичееких свойствах, скоростях синтеза и деградации, внутриклеточной концентрации и времен "полуяганм" кислой вакуолчрной про-теиназы - первичного метаболита, принимающего участие в регуляции гомеостаза клетки, что дополняет наш знания об обмене индивидуальных белков в культивируемых клеТ1<ах и его связи со вторичным метаболизмом. Кроме того, основываясь на полученных результатах и данных литературы, нами п; уложена модель регуляторного действия ауксинов и цитокшшнов, в которой протеиназа играет роль посредника
Структура и объем диссэртации. Работа изложена ч«л страницах, содержит / таблицы и ^рисунка. Она состоит ;го введения, обзора литературы, материалов к методов иссг яо~ ваний, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 281 наименование, из них 251 на иностранном языке.