Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Гипоталамо-гипофизарно-тестикулярная система . 12
1.1.1. Общие сведения о гипоталамо-гипофизарно-тестикулярной оси 12
1.1.2. Функции тестостерона в организме 13
1.1.3. Гипоталамическая регуляция репродуктивной системы 15
1.1.4. Гипофизарная регуляция репродуктивной системы 17
1.1.5. Регуляция синтеза тестостерона в семенниках с помощью рецептора лютеинизирующего гормона 19
Глава 2. Низкомолекулярные агонисты рецептора лютеинизирующего гормона 22
1.2.1. Классификация аллостерических регуляторов рецепторов GPCR 24
1.2.2. Особенности действия аллостерических регуляторов GPCR 26
1.2.3. Аллостерические регуляторы рецептора лютеинизирующего гормона 28
Глава 3. Стероидогенез в клетках Лейдига семенников 33
1.3.1. Транспорт холестерина в митохондрии 33
1.3.2. Регуляторный белок StAR 35
1.3.3. Синтез тестостерона в клетках Лейдига семенников 36
1.3.4. Нарушение стероидогенеза в клетках Лейдига при старении 39
1.3.5. Нарушение стероидогенеза при диабетической патологии 40
2. Материалы и методы 42
2.1. Разработка и синтез серии тиенопиримидиновых производных 42
2.2. Моделирование физиологических состояний и схемы экспериментов с использованием лабораторных животных 44
2.2.1. Схемы введения препаратов 44
2.2.2. Моделирование сахарного диабета 1-го типа 46
2.2.3. Изучение стареющих самцов крыс 47
2.3. Получение первичной культуры клеток Лейдига из семенников крыс 47
2.4. Выделение тестикулярных, тироидальных и овариальных мембран крыс 48
2.5. Измерение активности аденилатциклазы 49
2.6. Определение ГТФ-связывания G-белков 49
2.7. Иммуноферментный анализ 50
2.8. Выделение тотальной РНК, обратная транскрипция и количественная ПЦР в реальном времени 51
2.9. Статистическая обработка результатов 52
3. Результаты 53
3.1 Тиенопиримидиновые производные активируют рецептор ЛГ/ХГЧ, повышая активность аденилатциклазы, и селективно стимулируют Gs-белок в тестикулярных мембранах семенников, не влияя на рецептор ТТГ 53
3.1.1. Разработанные нами тиенопиримидиновые производные селективно активируют аденилатциклазу через рецептор ЛГ/ХГЧ, но не влияют на рецептор ТТГ 54
3.1.2. Тиенопиримидиновые производные селективно активируют Gs-белки в тестикулярных и овариальных мембранах 61
3.2. Тиенопиримидиновое производное ТП03 с активностью агониста рецептора ЛГ/ХГЧ стимулирует повышение уровня тестостерона и влияет на экспрессию стероидогенных генов в первичной культуре клеток Лейдига семенников 65
3.3. Тиенопиримидиновые производные повышают уровень тестостерона в крови и стимулируют стероидогенез в семенниках при разных способах и длительности их введения самцам крыс 69
3.3.1. Влияние однократного введения тиенопиримидиновых производных на уровень тестостерона и стероидогенез в семенниках крыс 69
3.3.2. Изучение влияния однократного введения ТП03 на стероидогенную функцию семенников крыс в сравнении с ХГЧ 70
3.3.3. Влияние длительного введения ТП03 и ХГЧ на уровень тестостерона и экспрессию в семенниках крыс 74
3.4. Стимулирующие эффекты ТП03 и ХГЧ на уровень тестостерона у самцов крыс при их однократном и длительном совместном введении 79
3.4.1. Влияние совместного действия тиенопиримидиновых производных и ХГЧ на активность АЦ в тестикулярных мембранах 79
3.4.2. Влияние однократного введения субмаксимальной дозы ХГЧ крысам, предварительно обработанным ТП03, на продукцию тестостерона 80
3.4.3. Влияние однократного и длительного введения ТП03 и ХГЧ в низких дозах на уровень тестостерона и стероидогенез в семенниках крыс 81
3.5. Влияние ТП03 на стероидогенную функцию семенников при старении и в условиях сахарного диабета 1-го типа. 86
3.5.1. Влияние старения на репродуктивную функцию крыс в возрасте 15 месяцев 87
3.5.2. Влияние обработки ТП03 и ХГЧ на уровень тестостерона и стероидогенез в семенниках стареющих самцов крыс 87
3.5.3. Влияние среднетяжелой формы сахарного диабета 1-го типа на уровень тестостерона и стероидогенез в семенниках крыс 91
3.5.4. Влияние ТП03 и ХГЧ на уровень тестостерона в крови и стероидогенез в семенниках крыс с СД1 92
4. Обсуждение результатов 98
5. Заключение 110
6. Выводы 111
7. Список цитируемой литературы 113
- Регуляция синтеза тестостерона в семенниках с помощью рецептора лютеинизирующего гормона
- Разработанные нами тиенопиримидиновые производные селективно активируют аденилатциклазу через рецептор ЛГ/ХГЧ, но не влияют на рецептор ТТГ
- Изучение влияния однократного введения ТП03 на стероидогенную функцию семенников крыс в сравнении с ХГЧ
- Влияние ТП03 и ХГЧ на уровень тестостерона в крови и стероидогенез в семенниках крыс с СД1
Регуляция синтеза тестостерона в семенниках с помощью рецептора лютеинизирующего гормона
Мишенями ЛГ и ХГЧ в семенниках являются тестостерон-продуцирующие клетки Лейдига. До сих пор не ясно, в какой именно структуре появляются клетки Лейдига в онтогенезе. Скорее всего, предшественники клеток Лейдига появляются в мезонефросе, где они начинают синтезировать андрогенные стероиды уже на 6–8-й неделях пренатального периода эмбрионального развития человека. Далее уровень тестостерона повышается в крови до 14–15-й недели пренатального периода, что соответствует увеличению количества предшественников клеток Лейдига. У новорожденных количество предшественников клеток Лейдига достигает 60% от количества зрелых клеток Лейдига взрослого мужчины. На второй месяц постнатального развития наблюдается второй пик уровня тестостерона. В пубертатный период происходит увеличение количества предшественников и их дифференцировка в зрелые клетки Лейдига. Примерно к двадцатилетнему возрасту количество клеток Лейдига достигает 5 108 на один семенник, а уровень тестостерона достигает своего третьего пика (Benton et al., 1995; Habert et al., 2001; Dong, Hardy, 2004, Tremblay, 2015).
Синтез тестостерона в клетках Лейдига регулируется ЛГ через рецепторы ЛГ/ХГЧ (Stocco et al., 2005; Manna et al., 2009). У мужчин эти рецепторы расположены на поверхности клеток Лейдига, у женщин на поверхности фолликулярных клеток яичников. В первом триместре беременности вырабатывается большое количество ХГЧ, который также специфично взаимодействует с рецептором ЛГ/ХГЧ (Ascoli, Segaloff, 1989; McFarland et al., 1989; Ascoli et al., 2002). Рецептор ЛГ/ХГЧ (75 кДа) относится к GPCR, но имеет ряд структурных особенностей, сближающих его с другими рецепторами гликопротеиновых гормонов – ТТГ и ФСГ. Из 674 аминокислотных остатков полипептидной цепи рецептора ЛГ/ХГЧ, почти половина приходится на эктодомен, который представляет собой череду лейцин-обогащенных повторов (LRR-повторы). Эта структура необходима для связывания гонадотропина. Таким образом, в отличие от большинства GPCR, рецепторы ЛГ/ХГЧ взаимодействуют с эндогенными лигандами с помощью эктодомена, а не внеклеточных петель и трансмембранного канала. При этом внутриклеточные петли рецептора и его цитоплазматический С-концевой домен участвуют во взаимодействии с G-белками (Dufau, 1998; Шпаков, 2009).
«Созревание» рецептора ЛГ/ХГЧ происходит в ЭПР и аппарате Гольджи, где помимо фолдинга рецепторов осуществляются его посттрансляционные модификации, в том числе гликозилирование, пальмитоилирование и убиквитинирование. При этом гликозилированию подвергается пять аминокислотных остатков рецептора ЛГ/ХГЧ, что обеспечивает рецептору осуществление «контроля качества» со стороны протеасом, которые вызывают деградацию рецепторов, не фосфорилированных должным образом, и позволяют транслоцироваться в плазматическую мембрану только правильно сложенным зрелым рецепторам. Пальмитоилирование рецептора ЛГ/ХГЧ осуществляется по двум аминокислотным остаткам, но не влияет на трафик рецептора в мембрану, как в случае рецептора ФСГ, играя важную роль в событиях, следующих за лиганд-рецепторным взаимодействием (Ulloa-Aguirre et al., 2017).
Вновь синтезированные рецепторы ЛГ/ХГЧ подвергаются многостадийному процессу фолдинга, в котором участвуют белки-шапероны и белки-спутники. Они функционируют как система контроля качества, которая при необходимости направляет и исправляет процесс фолдинга. Шапероны и им подобные белки не только обеспечивают доставку к плазматической мембране зрелых, правильно свернутых рецепторов, но и регулируют плотность рецепторов на мембране, предотвращают накопление в клетке неактивных или неправильно свернутых рецепторов (Ellgaard et al., 2016).
Взаимодействие ЛГ и ХГЧ с эктодоменом рецептора приводит к снятию ингибирующего влияния эктодомена на трансмембранный канал, изменению его конформации, что приводит к его ассоциации с Gs- и/или Gq/11-белками, а также с -аррестинами. Ассоциация рецептора ЛГ/ХГЧ с Gs-белком приводит к запуску цАМФ-зависимого сигналинга. Происходит обмен ГДФ на ГТФ, диссоциация гетеротримерного G-белка на - и /-субъединицы, в результате чего -субъединица стимулирует активность фермента аденилатциклазы, которая превращает АТФ во вторичный посредник цАМФ. Повышение уровня цАМФ приводит к активации цАМФ-зависимой протеинкиназы А (ПКА). Активация ПКА достигается диссоциацией гетеротетрамирного комплекса, включающего две регуляторные и две каталитические субъединицы, результатом чего является фосфорилирование каталитическими субъединицами ПКА-зависимых белков (Puett et al., 2007; Шпаков, 2009; Casarini et al., 2012; Choi, Smitz, 2014).
Среди ПКА-зависимых белков можно выделить эффекторные белки, регулирующие синтез тестостерона, и транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию генов, кодирующих ферменты стероидогенеза и связанные с ними белки. К первым относится белок StAR (Steroidogenic Acute Regulatory Protein), фосфорилирование которого стимулирует транспорт холестерина в митохондрии, к месту начала синтеза тестостерона. Ко второй группе белков относятся транскрипционные факторы, среди которых факторы семейства CREB, AP1 и ATF, которые будут подробнее освещены в третьей главе. При этом рецептор ЛГ/ХГЧ также сопряжен с Gq\11-белком, который связан с активацией фосфолипазы С и запуском кальциевого сигналинга, результатом которого является, в том числе, активация протеинкиназы С (ПКС). В отличие от ПКА, ПКС-зависимые белки в меньшей степени связаны с регуляцией стероидогенеза в клетках Лейдига, хотя есть убедительные доказательства того, что белок StAR и транскрипционные факторы AP1 и ATF-семейства фосфорилируются с помощью ПКС и МАПК (Manna et al., 2006, 2007; Midzak et al., 2009, Socanovic et al, 2014).
Еще одной важной группой белков, определяющих дальнейшую судьбу рецептора ЛГ/ХГЧ, являются -аррестины. Их основная функция – обеспечение интернализации лиганд-рецепторного комплекса. Интернализация и рециклиация GPCR – ключевой этап функционирования всей рецепторной системы и обеспечения ее стабильной работы (Casarini et al., 2016). Активацию -аррестинов обеспечивает процесс фосфорилирования рецептора ЛГ/ХГЧ по остаткам серина и треонина, расположенным в третьей внутриклеточной петле (ВП3) и в С-концевом домене рецептора, осуществляемый GRK-киназами (G-protein coupled receptor kinase). Взаимодействие рецептора с -аррестинами запускает связывание лиганд-рецепторного комплекса с клатрином и адапторными белками AP2, обеспечивающими эндоцитоз этого комплекса в составе эндосом внутрь клетки (Ulloa-Aguirre et al., 2017). Однако в последние годы появляются доказательства, что -аррестины осуществляют запуск каскада МАПК и, тем самым, регулируют процессы роста и дифференцировки клеток-мишеней (Gong et al., 2008; Song et al., 2009; Gupta et al., 2012).
Интересной является судьба рецепторов ЛГ/ХГЧ после интернализации. Рецепторы ЛГ рециклизуются лишь в небольшой степени и большая их часть подвергается деградацим в протеасомах. Лишь 30% рецепторов ЛГ рециклизуется, тогда как в случае рецептора ФСГ таких рецепторов 70%. Таким образом, система контроля синтеза и система интернализации/рециклизации регулируют количество рецепторов ЛГ в плазматической мембране клеток Лейдига, определяя их чувствительность к эндогенному ЛГ и контролируя интенсивность синтеза тестостерона.
На волне повышения интереса к гонадотропным гормонам, как индукторам овуляции и средствам для коррекции дефицита мужских и женских половых стероидных гормонов, в настоящее время растет необходимость поиска нового поколения препаратов, способных выполнять функции гонадотропинов, но без вышеописанных побочных эффектов. Основные надежды на успех в этой области связывают с наличием в трансмембранном домене рецептора ЛГ/ХГЧ высокоспецифичного аллостерического сайта, способного взаимодействовать с низкомолекулярными веществами, что приводит к изменению конформации рецептора и его активации. Известные в настоящее время сведения в области разработок низкомолекулярных агонистов рецептора ЛГ/ХГЧ обобщены в следующей главе.
Разработанные нами тиенопиримидиновые производные селективно активируют аденилатциклазу через рецептор ЛГ/ХГЧ, но не влияют на рецептор ТТГ
Разработка фармакологических препаратов с гормональной активностью требует оценки селективности их действия в отношении определенного типа рецептора. Одной из основных проблем при разработке агонистов рецепторов GPCR является возможность их взаимодействия с несколькими близкородственными рецепторами (Carpenter, Lebon, 2017). Рецептор ЛГ/ХГЧ имеет структурное сходство с другими рецепторами гипофизарных гликопротеиновых гормонов: рецепторами ТТГ и ФСГ. Аллостерический сайт связывания рецептора ЛГ/ХГЧ имеет сходную структуру с подобным сайтом рецептора ТТГ. Способность аллостерического агониста рецептора ЛГ/ХГЧ активировать, даже в небольшой степени, рецептор ТТГ может привести к развитию побочных эффектов со стороны тиреоидной системы, что будет выражаться в ее гипер- или, напротив, гипофункции, в зависимости от того, какой эффект, активирующий или ингибирующий, оказывает исследуемый агонист на рецептор ТТГ (Moore et al., 2006). Поэтому изучение рецепторной селективности аллостерических агонистов рецептора ЛГ/ХГЧ и отсутствие их регуляторного влияния на рецептор ТТГ является первостепенной задачей на начальных этапах их разработки. Активация рецептора ТТГ, как и в случае рецептора ЛГ/ХГЧ, приводит к диссоциации гетеротримерного Gs-белка и повышению активности АЦ, что вызывает повышение уровня цАМФ и активирует синтез тиреоидных гормонов. Поэтому нами было исследовано влияние ряда тиенопиримидиновых производных на активность АЦ в мембранах, выделенных из семеников крыс, где расположены рецепторы ЛГ/ХГЧ, а также на активность этого фермента в мембранах, выделенных из щитовидной железы животных, в условиях in vitro, а также на уровни тестостерона и тиреоидных гормонов в крови крыс в условиях in vivo при внутрибрюшинном введении им исследуемых ТП (Деркач и др., 2016).
На первом этапе было изучено влияние разрабатываемых нами ТП на активность аденилатциклазной системы во фракциях плазматических мембран, выделенных из семенников крысы. Для этого оценивали влияние семи впервые синтезированных и изученных нами соединений TП01, TП02, TП03, TП04, TП21, TП22 и TП23 на базальную активность АЦ в тестикулярных мембранах (Табл. 3).
Показано, что все разработанные нами ТП повышают активность АЦ, хотя и в меньшей степени, чем гонадотропин – ХГЧ. При этом наиболее эффективным было соединение ТП03, которое повышало базальную активность АЦ на 295% (Табл. 3). Исследовав концентрационную зависимость АЦ эффекта одних из наиболее активных соединений ТП03 и ТП04, было показано, что значение ЕС50 для них составило 386±32 и 763±17 нМ, соответственно (Рис. 10). Эти данные показывают, что разработанные нами ТП, в первую очередь ТП03, в микромолярных концентрациях повышают базальную активность АЦ в тестикулярных мембранах, функционируя как мощные стимуляторы аденилатциклазной сигнальной системы, ответственной за стероидогенез в клетках Лейдига (Деркач и др., 2016).
Далее изучали специфичность тиенопиримидиновых производных в отношении рецепторов ЛГ/ХГЧ, для чего оценивали их возможное влияние на активность АЦ в мембранах, выделенных из тканей щитовидной железы самцов крыс, где рецепторы ЛГ/ХГЧ отсутствуют, но представлены близкие им по структуре аллостерического сайта рецепторы ТТГ. Показано, что в тироидальных мембранах активность АЦ незначительно повышалась только под влиянием соединения ТП21, в то время как остальные ТП на активность фермента не влияли (Деркач и др., 2016; Бахтюков и др., 2019б) (Табл. 3).
Для оценки влияния тиенопиримидиновых производных на активность АЦ в тироидальных и тестикулярных мембранах, стимулированную ТТГ или ХГЧ, оценивали совместный эффект ТП и этих гормонов (Рис. 11). В тестикулярных мембранах был показан аддитивный эффект на активность АЦ при совместном воздействии тиенопиримидиновых производных (ТП01–ТП04, ТП23) и ХГЧ. При этом в мембранах щитовидной железы подобного эффекта не было выявлено. Только соединения ТП21 и, в незначительной степени, ТП02 оказывали незначительное ингибирующее влияние на стимулирующий АЦ эффект ТТГ (Рис. 11) (Бахтюков и др., 2019б). Таким образом, все разрабатываемые нами ТП, кроме ТП21, обладают высокой селективностью по отношению к рецептору ЛГ/ХГЧ в условиях in vitro.
Далее исследовали влияние тиенопиримидиновых производных на продукцию тестостерона, контролируемую через активацию аденилатциклазной системы, в условиях in vivo. Для этого соединения в дозе 25 мг/кг вводили самцам крыс внутрибрюшинно, уровень тестостерона измеряли через 1 и 3 ч. Максимальный уровень тестостерона был отмечен через 1 ч после введения ТП21, ТП22 и ТП23. Максимальный уровень тестостерона отмечали через 3 ч для соединений ТП01, ТП03 и ТП04. При этом эффект ТП03 на уровень тестостерона был более выражен, чем у других ТП (Табл. 4).
Далее оценивали аддитивность стероидогенных эффектов гонадотропинов и тиенопиримидиновых производных и возможные их антагонистические взаимоотношения в условиях in vivo (Рис. 12). Для этого исследовали эффект ТП03 на уровень тестостерона в условиях стимуляции самцов крыс люлиберином (гонадолиберином), рилизинг-фактором ЛГ и ФСГ. В ходе люлиберинового теста самцам крыс внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг вводили ТП03, растворенный в ДМСО. Через 30 мин в дозе 10 пг/крысу интраназально вводили люлиберин, растворенный в физиологическом растворе. Через 60, 120 и 180 мин после введения люлиберина забирали образцы крови для оценки уровня тестостерона. Показано, что обработка ТП03 вызывает повышение уровня тестостерона и усиливает эффект люлиберина, что может свидетельствовать об аддитивности стимулирующего воздействия на стероидогенез в клетках Лейдига аллостерического (ТП03) и ортостерического (гонадотропин, ЛГ) агонистов рецептора ЛГ/ХГЧ (Рис. 12).
На следующем этапе оценивали влияние ТП03 на рецептор ТТГ и функции щитовидной железы в условиях in vivo, для чего использовали тиролибериновый тест, в ходе которого животным интраназально вводили тиролиберин, рилизинг-фактор ТТГ, в дозе 300 мкг/кг. Через 60, 90 и 120 мин после введения тиролиберина забирали образцы крови для оценки уровня тиреоидных гормонов. Введение ТП03 не влияло на уровень тироксина и трийодтиронина, что доказывает отсутствие влияния ТП03 на рецептор ТТГ (Рис. 13) (Бахтюков и др., 2019б). На основе изучения влияния впервые разработанных нами тиенопиримидиновых производных на активность аденилатциклазной системы в тестикулярных и тироидальных мембранах и на синтез тестостерона и тиреоидных гормонов при введении самцам крыс показана селективность этих соединений в отношении рецептора ЛГ/ХГЧ и отсутствие заметного влияния на близкий по структуре рецептор ТТГ. Наибольшую специфическую активность показало вещество ТП03, которое было наиболее эффективным при стимуляции базальной активности АЦ в тестикулярных мембранах и как стимулятор продукции тестостерона при введении самцам крыс. В связи с этим, вещество ТП03 было выбрано для дальнейшего исследования молекулярных механизмов и мишеней действия аллостерических агонистов рецептора ЛГ/ХГЧ на основе структуры тиенопиримидина.
Изучение влияния однократного введения ТП03 на стероидогенную функцию семенников крыс в сравнении с ХГЧ
Для сравнительного изучения стероидогенной функции ТП и гонадотропинов в условиях in vivo, нами было изучено влияние ТП03 и ХГЧ на экспрессию генов рецептора ЛГ/ХГЧ и белка StAR, катализирующего скорость-лимитирующую стадию стероидогенеза – транспорт холестерина в митохондрии, и являющегося основным маркером активации стероидогенеза, а также генов, кодирующих ферменты стероидогенеза – митохондриальный фермент цитохром Р450scc (Cyp11a1), катализирующий превращение холестерина в прегненолон, ферменты эндоплазматического ретикулума 3HSD (Hsd3b), цитохром Р450с17 (Cyp17a1) и 17HSD (Hsd17b), осуществляющие дальнейшее превращение прегненолона сначала в прогестерон, затем в 17-ОН-прогестерон, андростендион и тестостерон (Stocco, 2000; Manna, Stocco, 2005). Для оценки активности стероидогенных ферментов были изучены концентрации тестостерона и его прекурсоров в семенниках крыс, обработанных ТП03 и ХГЧ (Бахтюков и др., 2019в).
Трехмесячным самцам крыс Wistar вводили ТП03 в дозе 15 мг/кг, в/б, через 3 ч забирали образцы крови из хвостовой вены для определения уровня тестостерона. Затем под наркозом крыс декапетировали, забирали ткани семенников, из которых выделяли РНК, проводили реакцию обратной транскрипции, в ходе которой нарабатывали кДНК, и с помощью ПЦР в реальном времени анализировали экспрессию мРНК целевых генов. Такой же эксперимент проводили с обработкой ХГЧ в дозе 100 МЕ/крысу, чтобы сравнить с ним действие ТП03 на стероидогенез. Уровень тестостерона после введения ТП03 и ХГЧ составил 53.6±14.1 и 171.3±14.4, что на 260 и 1047% превышает контрольные значения, равные 14.9±1.9.
Показано, что введение ТП03 и ХГЧ приводило к повышению экспрессии гена Star на 90 и 220%, соответственно (Рис. 19). Наряду с этим, однократное введение ТП03 вызывало повышение экспрессии гена Cyp17a1, кодирующего цитохром Р450c17, на 167%. Введение ХГЧ также повышало экспрессию Cyp17a1 на 146%, но при этом снижало экспрессию генов Hsd3b и Hsd17b на 71 и 43%, соответственно. На фоне изменений экспрессии генов ферментов синтеза тестостерона, однократное введение ХГЧ снижало экспрессию гена Lhr на 53% (Бахтюков и др., 2019в). Повышение экспрессии гена Star и снижение экспрессии гена Hsd3b при обработке клеток Лейдига ХГЧ было ранее показано другими авторами (Lejeune et al., 1998; Tang et al., 1998). С другой стороны, однократное введение 600 МЕ/крысу ХГЧ приводило к повышению экспрессии Cyp11a1 в семенниках взрослых самцов крыс и снижению экспрессии Cyp17a1 (Lu et al., 1991). Подобный результат может быть связан с использованием в нашем исследовании более низких доз ХГЧ. Снижение экспрессии Lhr может быть одной из первопричин уменьшения чувствительности клеток Лейдига к действию гонадотропинов, что является частым осложнением при использовании ХГЧ и ЛГ в медицине (Banker et al., 2015; Riccetti et al., 2017).
Обработка ТП03 и ХГЧ привела не только к изменению экспрессии генов, но и к изменению активности ферментов, участвующих в синтезе тестостерона. Для того, чтобы изучить влияние ТП03 и ХГЧ на активность ферментов синтеза тестостерона, были измерены уровни стероидных гормонов в семенниках самцов крыс. Наркотизированные крысы были декапитированы спустя 30 мин после введения ТП03 в дозе 15 мг/кг и ХГЧ в дозе 100 МЕ/крысу. Затем были взяты ткани семенников, в которых с помощью ИФА измеряли уровни прегненолона – продукта цитохрома Р450scc, прогестерона – продукта 3HSD, 17-ОН-прогестерона и андростендиона, продуктов Р450с17, и тестостерона – продукта 17HSD. Выбор 30-минутного интервала был продиктован необходимостью проследить изменения активности ферментов, без влияния на него изменения экспрессии. Ранее нами было показано, что через 30 мин экспрессия генов стероидогенеза под действием ХГЧ и ТП03 практически не менялась.
Однократное введение ТП03 и ХГЧ приводило к повышению уровня тестостерона в семенниках на 84 и 512%, соответственно (Табл. 5). Подобный результат хорошо соотносится с данными, полученными при изучении уровня тестостерона в крови. На фоне повышения уровня тестостерона в крови и семенниках, уровень прегненолона в семенниках при обработке ТП03 и ХГЧ снижался на 40 и 62%, соответственно (Бахтюков и др., 2019в). Это можно объяснить быстрой конверсией прегненолона в прогестерон, и далее в 17-ОН-прогестерон и андростендион ферментами дегидрогеназой 3HSD и цитохромом Р450с17. Как известно, 17-ОН-гидроксилазная активность цитохрома Р450с17 приводит к образованию 17-ОН-прогестерона (Dong, Hardy, 2004; Luuhe, 2013). Обработка ХГЧ и ТП03 вызывала повышение уровня 17-ОН-прогестерона на 586 и 41%, соответственно. Результатом 17,20-лиазной активности цитохрома Р450с17 является образование андростендиона (Dong, Hardy, 2004; Luuhe, 2013). Обработка ХГЧ и ТП03 приводила к повышению уровня андростендиона на 225 и 70%, соответственно. Обработка ХГЧ вызывала более выраженное повышение уровней 17-ОН-прогестерона и андростендиона, чем в случае ТП03 (Табл. 5.) (Бахтюков и др., 2019в). Полученные данные хорошо соотносятся с данными по экспрессии гена Cyp17a1, кодирующего цитохром Р450с17, которая повышалась при однократной обработке ТП03 и ХГЧ.
Соотношение 17-ОН-гидроксилазной и 17,20-лиазной активности цитохрома Р450с17 используется для оценки эффективности процесса синтеза тестостерона (Miller et al., 1997; Sondhi et al., 2016). Поэтому логично проанализировать отношение уровня 17-ОН-прогестерона к уровню андростендиона (17-ОН-прогестерон/андростендион) в семенниках крыс. При этом увеличение отношения 17-ОН-прогестерон/андростендион в сторону повышения уровня 17-ОН прогестерона означает преобладание 17-ОН-гидроксилазной активности над 17,20-лиазной активностью, что говорит о дисбалансе уровня предшественников тестостерона, который в дальнейшем вызывает ослабление стероидогенеза. Отношение 17-ОН прогестерон/андростендион при обработке ХГЧ составляет 2.1, а при обработке ТП03 – 0.8. Исходя из этих данных, можно предположить, что обработка ТП03, в отличие от ХГЧ, не приводит к увеличению отношения 17-ОН-прогестерон/андростендион. Это может указывать на более высокую эффективность синтеза тестостерона без необходимости значительного повышения экспрессии белка StAR и уровней стероидных метаболитов 17-ОН-прогестерона и андростендиона при обработке самцов крыс низкомолекулярным агонистом.
Таким образом, однократная обработка самцов крыс ТПОЗ вызывает повышение уровня тестостерона, которое обусловлено усилением стероидогенеза в семенниках, что выражается в повышении экспрессии гена транспортного белка StAR и фермента цитохром Р450с17, а также его продуктов 17-ОН-прогестерона и андростендиона. При этом не происходит снижения экспрессии гена Lhr, кодирующего рецептор ЛГ/ХГЧ, и повышения отношения 17-ОН-прогестерон/андростендион, которое отмечается при обработке животных с помощью ХГЧ.
Влияние ТП03 и ХГЧ на уровень тестостерона в крови и стероидогенез в семенниках крыс с СД1
Для изучения влияния тиенопиримидиновых производных и гонадотропинов на уровень тестостерона в крови и на систему стероидогенеза у самцов крыс с СД1 осуществляли однократную обработку контрольных и диабетических животных с помощью ТП03 и ХГЧ. Оба препарата повышали уровень тестостерона в крови в обеих группах животных, но стероидогенный эффект в группе Д был ниже, чем в контроле, на что указывают значения AUC 9.0015.00 (Рис. 30). Так AUC 9.0015.00 в диабетических группах с обработкой ХГЧ и ТП03 (ДГ и ДТ) были на 66 и 48% ниже, чем в соответствующих им контрольных группах КГ и КТ. Уровни тестостерона во всех временных точках при обработке диабетических крыс ХГЧ и ТП03 отличались от таковых в группах КГ и КТ, за исключением групп КТ и ДТ через 1 ч после обработки TП03. Обработка диабетических крыс с помощью ХГЧ и TП03 в течение 5 дней существенно не влияла на массу тела, уровни глюкозы, инсулина и лептина (Табл. 1). Введение ХГЧ приводило к повышению массы семенников – у контрольных крыс она повышалась на 12%, у диабетических крыс – на 13 % (Табл. 1). Обработка TП03 в небольшой степени влияла на массу семенников (Бахтюков и др., 2019а).
У контрольных животных в 5-й день, через 3 ч после обработки ХГЧ, стимулирующий эффект ХГЧ на продукцию тестостерона снижался в сравнении с первым днем обработки, а соответствующий эффект TП03 не менялся (Рис. 31). В группе диабетических крыс, которых 5 дней обрабатывали ХГЧ, стероидогенный эффект ХГЧ менялся незначительно, оставаясь ниже такового в группе КГ. В группе с обработкой TП03 стероидогенный эффект на уровень тестостерона этого агониста повышался в 2 раза и был сопоставимым с таковым в группе КТ (Рис. 31). Таким образом, в отличие от ХГЧ, стероидогенный эффект TП03 при длительном введении диабетическим крысам возрастал, чего не наблюдали у контрольных животных, и это указывает на кумулятивность стероидогенного эффекта TП03 при среднетяжелом СД1 (Бахтюков и др., 2019а).
После 5 дней обработки ХГЧ и TП03 оценивали экспрессию генов, кодирующих рецептор ЛГ/ХГЧ (Lhr), транспортный белок StAR (Star), и гены, кодирующие ферменты синтеза тетсостерона. В семенниках крыс с СД1 экспрессия генов Lhr и Star снижалась, а экспрессия генов, кодирующих ферменты стероидогенеза, существенно не менялась (Рис. 32). Обработка ХГЧ контрольных крыс приводила к снижению экспрессии генов Lhr и Hsd7b и повышала экспрессию других изучаемых генов. В семенниках крыс с СД1 стимулирующий эффект ХГЧ на экспрессию генов Star, Cyp11a1 и Cyp17a1 сохранялся, но был выражен в меньшей степени в сравнении с контролем, в то время как эффект ХГЧ на экспрессию гена Hsd3b усиливался с 62 до 240%. В группе ДГ не было выявлено ингибирующего эффекта ХГЧ на экспрессию Hsd17b, которая сохранялась на контрольном уровне. В группе ДГ подавлялась экспрессия гена Lhr, которая составила 11 и 16% от ее уровня в группах К и Д (Рис. 32). В контроле обработка TП03 повышала экспрессию генов для StAR-белка и цитохрома Р450с17, слабо влияя на экспрессию других генов. Соединение TП03 в 2.5 раза повышало экспрессию гена Lhr, вызывая эффект,Пятидневное лечение животных с СД1 с помощью ТП03 в дозе 15 мг/кг и ХГЧ в дозе 100 МЕ/крысу показало, что эффекты ТП03 и ХГЧ на уровень тестостерона, которые у контрольных животных значительно отличаются, в случае диабетических животных становятся сопоставимыми (Рис 31). При этом наблюдается ослабление стимулирующего эффекта ХГЧ на стероидогенез в семенниках, которое выражается в снижении экспрессии генов, кодидующих StAR и ферменты синтеза тестостерона по сравнению с контрольными животными. При изучении экспрессии генов стероидогенеза показано, что ТП03 не снижает экспрессии Lhr, что, как и в случае стареющих крыс, происходит при обработке ХГЧ (Рис. 32). Таким образом, полученные данные показывают, что использование ТП03 для коррекции андрогенного дефицита у самцов крыс со среднетяжелым СД1 приводит к повышению уровня тестостерона, но при этом не вызывает снижения чувствительности клеток Лейдига к действию эндогенных гонадотропинов. При этом не наблюдается значительных изменений экспрессии генов, кодирующих ферменты синтеза тестостерона, что говорит о сбалансированной работе этих ферментов при их стимуляции низкомолекулярными аллостерическими агонистами рецептора ЛГ/ХГЧ (Бахтюков и др., 2019а).