Использование рибофлавинсвязывающего апобелка для биохимической оценки обеспеченности витамином В2 организма взрослых и детей Вржесинская, Оксана Александровна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Для оценки обеспеченности организма витамином В₃ проводят определение экскреции рибофлавина с мочой, его концентрации в плазме крови и эритроцитах, а также используют функциональный тест - коэффициент активации ГР эритроцитов экзогенным ФАД (ФАД-эффект). Вопрос о том, как эти показатели коррелируют между собой и какому из них отдать предпочтение, продолжает дискутироваться (Horwitt М.К., 1984, 1986; Bates G.J., 1987; Chen H.Y., 1992). До сих пор не существует единого мнения о критериях, т.е. минимальных величинах каждого показателя, соответствующих нормальной обеспеченности организма рибофлавином (Bates С, 1993). По мнению одних авторов, об адекватной обеспеченности свидетельствуют величины ФАД-эффекта менее 1,2 (Bamji M.S., 1969; Sauberlich Н.Е. е.а., 1972; Belko A.Z. е.а., 1983; Хотимченко С.А. с соавт., 1987), других - менее 1,3 (Ross N.S., 1992), 1,4 (Glatzle D. е.а., 1970; Bates C.J. е.а., 1987, 1989) и даже 1,7 (Bayoumi R.A., 1976). Многостадийность, недостаточная специфичность методов определения рибофлавина в плазме крови (Burch Н.В. е.а., 1948; Sancar D., 1978) послужили причиной того, что этот способ оценки рибофлавинового статуса организма не получил широкого распространения (Suvarnakich К. е.а., 1952; Lust J.E. е.а., 1954; Bessey О.А. е. а., 1956). Отчасти этим же объясняется и недостаточно широкое применение для этой цели величин экскреции рибофлавина с мочой. Появившиеся в последнее время методы определения рибофлавина в плазме крови и моче с помощью ВЭЖХ высокоспецифичны и чувствительны (Gatautls V.J. е.а., 1981; BottlcherB., 1987; StraubR.H., 1993), но требуют дорогостоящего оборудования и особо чистых реактивов.

Таким образом, поиск и разработка новых специфичных, надежных и простых методов определения рибофлавина, а также установление критериев нормальной обеспеченности организма этим витамином по-прежнему представляют собой чрезвычайно актуальную проблему.

Доступность сбора мочи, казалось бы, делает удобным проведение оценки рибофлавинового статуса по величине часовой экскреции витамина. Однако существенным препятствием для использования этого показателя является отсутствие общепринятых критериев для детей различного возраста. Применение в этих целях критерия, принятого для взрослых, недопустимо в связи с существенными возрастными от-

Принятые сокращения: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хромато графия; ГР - глутатионредуктаза; РбСБ - рибофлавинсвязывающий апо-белок; ФАД - флавин-аденин-динуклеотид.

2 личиями в потребности, уровне потребления и степени утилизации витамина Bg у детей, и взрослых. Сведения о суточной экскреции витаминов у детей различного возраста носят фрагментарный характер (Ritchey S.W., 1966; Хмелевский Ю.В., Усатенко O.K., 1987) и имеются единичные данные о нормах часовой экскреции (Смирнов М.И., 1966). В связи с этим установление величин экскреции рибофлавина, характерных для нормальной обеспеченности организма детей различного возраста витамином В₂, является весьма актуальной задачей.

Недавно появились сообщения о количественном определении рибофлавина в моче (Tillotson J.А. е.а., 1980, 1986) и молоке (Lotter S.E. е.а., 1982; Вржесинская О.А. с соавт., 1993) с помощью природного переносчика рибофлавина РбСБ из белка куриных яиц. В его основе леяит способность этого апобелка при связывании с высоким сродством в эквимолярном соотношении с рибофлавином полностью тужить его флуоресценцию (White Н.В. е.а., 1988). К комплекса РбСБ с рибофлавином (1,5 нМ) на 3-4 порядка ниже, чем для ФАД и ФМН (Becvar J. е.а., 1982; Lotter S.E. е.а., 1982; White Н.В., 1986). В связи с этим представлялось перспективным выделить и использовать препарат РбСБ для определения рибофлавина в моче и плазме крови, установить критерии нормальной обеспеченности витамином В₂, что позволило Он выявлять недостаточность этого витамина у разных групп населения.

Исследования проводились в соответствии с планами НИР Института питания РАМН по темам 042: Разработка унифицированной системы критериев и методов оценки витаминной обеспеченности человека для диагностики гиповитаминозных состояний и нарушений витаминного обмена (1988-1992); и 083: Зависимость показателей витаминного статуса от обеспеченности организма рибофлавином и разработка возрастных показателей обеспеченности организма витаминами группы В в норме и при различных заболеваниях (1993-1995).

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в разработке на основе использования РбСБ биохимических методов оценки обеспеченности организма витамином В,, уточнении и установлении критериев нормальной обеспеченности им взрослых и детей.

В соответствии с поставленной целью предполагалось решить следующие задачи:

I. Выделить РбСБ из белка куриного яйца и охарактеризовать его свойства. Разработать методы определения рибофлавина в плазме крови, органах и тканях животных с применением этого апобелка.

!

1. Сравнить разработанные методы определения рибофлавина с традиционными и ВЭ5КХ.

2. Исследовать в эксперименте на крысах зависимость содержания рибофлавина в крови, экскреции с мочой от поступления с рационом, а также от степени насыщенности организма этим витамином. Используя корреляционный анализ оценить взаимозаменяемость показателей обеспеченности организма животных и человека витамином В₂.

3. На основании разработанных методов установить критерии нормальной обеспеченности (концентрация рибофлавина в плазме крови и его часовая экскреция с мочой) взрослых и детей дошкольного и школьного возраста витамином В,.

Научная новизна работы. Разработан принципиально новый биоспецифичный экспресс-метод определения рибофлавина в плазме крови и тканях, сопоставимый по чувствительности с методом ВЭЖХ, но менее трудоемкий и не требующий дорогостоящего оборудования, в основе которого лежит связывание РбСБ с рибофлавином в эквимолярном соотношении с высоким сродством.

Разработан подход для установления критериев обеспеченности организма витамином Во, основанный на математической обработке кривых взаимозависимости экскреции рибофлавина с мочой от его содержания в плазме крови, эритроцитах и величины ФАД-эффекта.

Продемонстрировано, что концентрация рибофлавина в плазме крови, его часовая экскреция с мочой, определенные титрованием РбСБ, отражают поступление витамина В₂ с рационом и степень насыщенности им организма, хорошо коррелируют между собой, а также с его содержанием в эритроцитах и величиной ФАД-эффекта, что позволяет надежно выявлять недостаточность этого витамина с помощью любого из этих биохимических показателей.

Установлена концентрация рибофлавина в плазме крови, характерная для нормальной обеспеченности организма здорового человека витамином В₂, а также величины часовой экскреции рибофлавина с мочой для здоровых детей 3-4, 5-7, 9-ІІ и 12-14 лет.

Научно-практическое значение работы. Разработан новый высокочувствительный и специфичный флуоресцентный экспресс-метод титрования рибофлавина в плазме крови и тканях с помощью РбСБ, нашедший применение в медицинских институтах России и Украины. Получено удостоверение на рационализаторское предложение "Метод количественного определения рибофлавина в плазме (сыворотке) крови с помощью рибофлавинсвязывающего апобелка" J* 63/90-3.

Установленные критерии нормальной часовой экскреции рибофлавина у детей разного возраста используются для оценки рибофлавино-вого статуса детей.

Предложенные методы были применены при апробации обогащения готовых блюд на молочной основе поливитаминным премиксом 730/4 для улучшения витаминного статуса детей. Результаты использованы при разработке совместно с кафедрой питания детей и подростков ЦОЛИУВ Информационного письма и инструкции "Профилактическая витаминизация детей в дошкольных, школьных, лечебно-профилактических учреждениях и домашних условиях" (Минздрав РФ, Москва, 1994 г.).

Апробация диссертации. Результаты исследований доложены на

Всесоюзном совещании "Реализация научно-технической программы "Витаминизация пищи" (Углич, 1990); Всесоюзной конференции "Клиническая витаминология" (Москва, 1991); республиканской научной конференции "Питание и здоровье" (Таллинн, 1991); Всесоюзной научно-технической конференции "Совершенствование технологических процессов производства новых видов пищевых продуктов и добавок" (Киев, 1991); I Конгрессе "Vitamins and Biofactors in Life Science" (Japan, 1991); V Национальном Конгрессе по питанию (Болгария, 1993); заседании секции "Витаминологии" МОИП (1992, 1993); конференции "Проблемы рационального питания детского и взрослого населения, проживающего на территориях, пострадавших в результате ава-Shh на Чернобыльской АЭС" (Брянск, 1993); научно-практической кон-еренции ^'Радиационно-экологические и медицинские аспекты последствий аварии на Чернобыльской АЭС" (Киев, 1993); международном конгрессе "Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты" (Москва, 1994); научно-практической межреспубликанской конференции "Проблемы детского питания в условиях формирования рыночных отношений" (Екатеринбург, 1994); 7 Европейской конференции "Over- and Undernutrition" (Австрия, 1995); международном симпозиуме "Витамины и здоровье населения Беларуси и смежных регионов (Гродно, 1995); 2 Симпозиуме "Неинвазивные методы диагностики" (Москва, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 работ.

Объем и структура работы, диссертационная работа, общим объемом 143 стр., состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и библиографического указателя (207 источников), содержит IG табл. и 20 рис.

С-О-Д-Е-Р-К-А-Н-И-Е—Р-А-Б-0-Т-Ы