Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Актуальность изучения таких важнейших регуляторных белков иммунной системы как цитокины, в том числе фактора некроза опухолей альфа человека особенно возросла в последнее десятилетие в связи с поиском новых эффективных методов диагностики и лечения многих заболеваний, таких как СПИД, рак, различные аутоиммунные заболевания и нарушения иммунитета. В нашей республике актуальность исследований в области иммунологии обусловлена также ситуацией, сложившейся после аварии на Чернобыльской АЭС. Анализ белков с помощью моноклоналышх антител (МКА), и, в том числе, иммуноферментного метода, в научной работе и в практическом здравоохранении применяется повсеместно. Однако тест-системы по определению цитокинов производят исключительно за рубежом, они очень дороги и поэтому малодоступны для широкого круга исследователей Беларуси.
Связь работы с научными программами, темами. Работа выполнена в рамках темя: "Разработать современные биотехнологические подходы для исследования медиаторов иммунитета и кроветворения", № гос. регистрации 01.9.10018156, являющейся частью республиканской научно-технической программы "Здоровье" (1991-1995г.). Работа была также поддержана финансированием Фонда Фундаментальных исследований Республики Беларусь, в 1994-95г. Часть исследований проводилась в рамках темы: "Создать тест-системы для определения растворимого рецептора Р-55 фактора некроза опухолей и провести их клинико-эксперименталыгую апробацию при инфекционной патологии", № гос. регистрации 1997287/27.01.1997г.
Цель и задачи исследования: характеристика свойств гомологичного твердофазного иммуноферментного анализа, условий его применения для изучения и измерения олигомерных цитокинов - фактора некроза опухолей альфа (ФНб) и интерлейкина-8 (ИЛ-8), а также адаптация метода для измерения низких (физиологических) концентраций олигомерного ФИО в биологических жидкостях. .
Необходимо было решить следующие конкретные задачи:
- определить наиболее важные физико-химические свойства антител, влияющие на чувствительность метода гомологичного ИФА (Гм-ИФА);
- изучить влияние неионного детергента Твин-20 на чувствительность Гм-ИФА;
- оптимизировать условия измерения природного олигомерного ФНО в биологических жидкостях методом Гм-ИФА;
- изучить возможность регистрации молекулярных комплексов ФНО с растворимым рецептором Р-55 методом гомологичного ИФА.
Объект исследования. Объектом исследования являются важнейшие регуляторные белки иммунной системы - фактор некроза опухолей альфа человека и интерлейкин-8, а также комплекс фактора некроза опухолей с растворимым Р-55 рецептором.
Методология и методы проведенного исследования. Применяемые в работе методы основаны на использовании перспективных продуктов современной биотехнологии - моноклональных антител. В работе использованы современные методы иммунохимии: аффинная очистка н биотинилирование моноклональных антител, иммуноферментный и радиоиммунный анализ, эпитопный анализ, иммуноблотганг.
Научная новизна работы. Известно, что биологическая активності ФНО связана с сохранением четвертичной структуры цитокина /Smith апс Baglioni, 1987/. Однако, до проведения настоящего исследования не существовало достаточно чувствительного метода определения олигомерої природных цитокинов в физиологических концентрациях. Мето; гомологичного ИФА ФНО впервые адаптирован для количественной: определения олигомерного ФНО в физиологически значимых концентрация? в плазме и сыворотке крови человека. Предложенный вариант анализе превосходит по чувствительности наилучший из известных в 50 раз. Впервьн разработан вариант иммунофер-ментного определения олигомерногс интерлейкина-8 человека. Впервые обнаружено значительное уменьшение чувствительности гомологичного ИФА в присутствии 0,05% детергента Твин 20, причиной которого является диссоциация олигомерного белка дс мономеров, происходящая в процессе анализа. Определены наиболее важньк физико-химические свойства антител, используемых в методе гомологичной ИФА. Впервые показана возможность выявления комплексов ФНО < растворимым рецептором Р-55 с помощью ИФА. Научная значимості полученных результатов заключается в возможности созданяі чувствительного гомологичного ИФА, единственного метода, позволяющей оценивать олигомерное состояние природных белков в биологическоі жидкости в пикомолярных концентрациях. Разработанные и описанные і данной работе варианты иммуноферментного определения ФНС использовались в научных исследованиях фундаментального и прикладной характера /Чалый и др., 1996; 2,3/.
Практическая значимость полученных результатов. Изученные : данной работе закономерности и разработанные вариант* иммуноферментного определения цитокинов могут стать основой дл создания и производства коммерческих тест-систем и широкого применени их в исследовательской практике.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту. 1. Разработка сэндвич-варианта иммуноферментного анализа ФНС основанного на использовании одних моноклональных антител, чт
позволяет доказать возможность Гм-ИФА определять олигомерный ФНО с высокой чувствительностью в диапазоне концентраций 15-2000 пг/мл.
2. Разработка гомологичного варианта ИФА интерлейкина-8, что
позволит установить существование олигомерной формы ИЛ-8 в диапазоне
концентраций 1-10 нг/мл.
3. Определение аффинности, нейтрализующей способности и-
эпигопной специфичности моноклональных антител против ФНО, что
позволит установить зависимость между чувствительностью гомологичного
ИФА ФНО и свойствами используемых при проведении анализа антител.
4. Оценка влияния неионного детергента Твин-20 в концентрации
0,05%, на чувствительность разработанных вариантов гомологичного и
гетерологичного ИФА ФНО и ИЛ-8, что показывает возможность
применения данных методов для регистрации изменений четвертичной
структуры белков в низкой концентраций и в присутствии других
биомолекул.
5. Адаптация вариантов гомологичного ИФА для определения
природного олигомера ФНО в пикомолярных физиологически значимых
концентрациях в биологической жидкости и для регистрации его комплекса с
растворимым Р-55 рецептором, что позволит получить ранее недоступные
сведения о содержании и соотношении различных форм антигена в
биологической жидкости в норме и при патологии.
Личный вклад соискателя. Представленные в работе результаты исследования получены и проанализированы лично автором.
Апробация результатов диссертации. Результаты научных исследований докладывались: на международном симпозиуме "Structure & Function of Regulatory Polypeptides", Москва, 1992; на 8 Международном конгрессе по иммунологии, Будапешт 1992г.; на совместном заседании 8-го Международного рабочего совещания по лимфокинам и 4-го Международного рабочего совещания по цитокинам, г. Осака, Япония, 1993г.; на Ш Центрально-европейской летней школе по иммунологии, г. Кошице, Словакия, 1994г.; на IV Центрально-европейской летней школе по иммунологии, г. Прага, 1995г., где работа заняла Ш место в конкурсе стендовых докладов; на ГП съезде Белорусского научного общества иммунологов и аллергологов "Актуальные проблемы иммунологии и anneprononra" - Гродно, 1995г.; на Ш Международной летней школе им. Дж. Хамфри, г. Пушино, Россия, 1996г и на IV Международной летней программе по иммунологии им. Дж. Хамфри, г. Пущино, Россия, 1998г.
Опубликованность результатов. Результаты, вошедшие в данный труд, опубликованы в трёх статьях в научных журналах, трех статьях в сборниках, одном авторском свидетельстве, 10 тезисах конференций и симпозиумов, что в сумме составляет 44 страницы.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 94 стр. и
состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, списка литературы и приложения. Список цитируемой литературы содержит 122 источника. Диссертация содержит 18 рисунков, 5 таблиц и 1 Приложение.