Введение к работе
. Актуальности темы. Изучение механизмов действия нейропептидов, выделяемых гипоталамусам и регулирующих деятельность периферических яепез внутренний секреции через гипоталлмо — гиповизпрную систему, является одной из наиболее актуальных задач ссЕр>менной Биохимии. Кортикотропин — релизинг — *актор заслуживает в этой связи особо пристального внимания, поскольку он, регулируя уровень ндренокортикотролного гормона, оказывает определяющее влияние на секрецию глюкокортикоидов — ключевых гормонов стресса, вызьшаюцих ц^лый ряд негативных изменений в различных Функциональных системах организма, в том числе в иммунной системе, в условиях длительного стресса.
Весьма актуальной является проблема установления взаимосвязи между структурными оссбемностями пептидных гормонов и их функциональными характеристиками. В отношении корти ко Либерии а имеется значительный гтрогресс в изучении его отруктурных характеристик, тогда как установление Функциональной роли выявленных структурных особенностей оотается пока малоисследованным.
Весьма удобным инструментом для решения вышеуказанных задач явлнетоя использование момоклональных антител. Ноноклональные антитела опааифичкеки спяливаются о определенным эпмтопом на молекуле пягстида, позволяя идентифицировать этот эпитол. Сопоставление биологимвоких эффектов монокленпльных антител о их специфичностью к определенным антигенным детерминантам позволяют поБитъоя существенного прогресса как в изучении механизма действия данного белка, так и в изучении аго структурно — Функциональных характеристик.
Монокгюнальныа антитела позволяют успешно решать и другу» ватную проблему, возникающую при изучении биологически активных пептидов, действующих в чрезвычайно малых концентрациях! они дают возможность создания высокочувствительных иммуноферментных теот - систем, позволяющих точно определять концентрацию данного гормона в биологических образцах.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлось! (а) — получение клона» гибридом, секретирумщих моноклональные антитела к рпэличным эпитопам на молекуле человечеокого кортиколиберина; (В> — соозяанив высокочувствительной иммуноферментной тест - системы для определения концентрации человеческого кортиколиберина; (в) — характеризацня антигенных детерминант полученных моноклональиых антител; (г) — исследование типов клеток, секретирумщих кортиколиберин, и определение' факторов, стимулирующих его секрецию, с помощью разработанной тест — системы. В соответствии с этим в план работы входило! гибридизация соматических клеток с целью получения гибридом, оптимизация условий иммуно»ермзнтного диагностирования человеческого кортиколиберина, химическая модификация аминокислотных остатков кортиколиберина, измерение концентрации данного пептида в культуральных жидкостях первичных и перевиваемых культур в ответ на различные стимуляторы.
Научная новизна и практическая ценнооть работы.
Были получены моноклональные антитела к кортиколиберипу человека, определен характер антигенных детерминант и константы связывания для двух клонов антител и показано отсутствие конкуренции мсяду ними за участки связывания о антигеном. Впервые было обиарум^но, что опоесбяоотью оекретировать кортиколиберин обладают В — и Т - лимооциты человека, ко не макрофаги и не грпнулециты. Впервые было показано, что секрецию кортиколиберина стимулируют не только актиааторы пролиферации лимфоцитов, но и «акторы клеточного стресса.
Практическая ценность работы состоит в том, что впервыа Была создана иммуноверментная тест — система для определения кортиколиберина на основе моноклональиых антител, позволяющая определять антиген в концентрациях до 50 пг/мл. Поскольку изменения концентрации кортиколиберина являются характерным признаком таких патологий, как синдромы Кашинга и Нельсона, болезнь Аддисона, то данная тест — система является ценным инструментом для их ранней диагностики.
Апробация работы.
Материалы диссертации были доложены на международной
конференции "Структура и функции регуляторних пептидов" ( Москва 1992 > и на лаВораторном семинаре департамента виотвхнологии ВНЦ МЯЛ МЗ России ( декабрь 1993 ). Структура и объем работы.
Диссертационная работа содержит оледумтие разделы! введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы, изложена на 103 отраницах машинописного текста и включает 25 рисунков и 4 таблицы. Библиография включает 131 источник, из них 3 русоких и 148 иностранных источника.
Список сокращений.
CRF - кортикотропин - релизинг - «актор, PBS - забуференный физиологический раствор, PBS-AT - PBS о 0,5Х бычьим сывс^оточным альбумином и 0,05Х Tween-20, ИФА -иммуноферментный анализ, Л — оптическая плотность.