Иммуноферментный анализ сывороточных апопротеинов А-I, В и Е в условиях стресса Потеряева, Ольга Николаевна

Введение к работе

- З -

Актуальность исследований. Проблема адаптации при действии на организм субэкстремальных и экстремальных факторов является одной ив центральных в современной медико-биологической науке (Панин Л. Е., 1978; Казначеев Е П. , 1980; меерсон Ф. 3. , 1985).

Существенным моментом в сложной перестройке эндокринно-ме-таболических вааимотношений при стрессе является изменение содержания в крови липопротеинов и их спектра. Известно, что взаимодействие и поглощение липопротеинов клетками определяются прежде всего входящими в их состав апопротеинами. Апопротеины обеспечивают транспорт холестерина С Климов А. Н. , 1980), рецеп-торное узнавание липопротеинов различными клетками (Brown, Goldstein. 1979; Van Berkel е. a , 1980), изменяют активность ряда внеклеточных (Fielding е. а., 1972; Dolfin, 1985) и внутриклеточных ферментов (Панин Л.Е. , 1983; Панин Л. Е. и др. 1991).

Вопросы, касающиеся изучения апопротекнов в условиях напряжения организма, вплоть до настоящего времени оставались вне сферы внимания исследователей. Имеются единичные работы, в которых изучалось влияние голодания на продукцию апопротеинов у лабораторных животных (Davis е. а. , 198Б; Sherman, .Weinberg 1988; Kim е. a. , 1989) или влияние непродолжительных физических упражнений на содержание апопротеинов в крови у людей (Krauss. 1977; Berg е. а., 1986, Foline. а 1988; Lamon-fava 19881. Данных об изменении апопроіеинового спектра крови при стрессе как у человека, так и животных в доступной нам литературе мн не встретили. До сих пор не изучены изменения апопротеинсвого спектра в восстановительный период после стресса. Недостаточно исследована роль липопротеинов, и тем более апопротеинов, в компенсаторных реакциях организма при длительном охлаждении.

Цль исследований изучить особенности изменений содержания апо А-І, апо В и апо Е в сыворотке крови у человека и животных при действии на организм субэкстремальных и экстремальных факторов, провести сравнительный анализ этих изменений с изменениями липопротеидного спектра крови и определить их информативную значимость в системе адаптационной перестройки липидного обмена.

- 4 -Для достижения этой цели были поставлены следующие эадачи:

1. Провести оптимизацию метода иммуноферментного определения апопротеинов, включая получение и идентификацию антигенов и антител, выбор рабочих режимов, способов обработки сыворотки и другого биологического материала для более полного выявления антигенных детерминант.

2. Выявить изменения в содержании апопротеинов А-I и В в крови у людей в условиях Крайнего Севера и Антарктиды с целью диагностики некоторых предпатологических состояний.

3. Изучить влияние интенсивной физической нагрузки на содержание апопротеинов А-I и В в сыворотке крови у мужчин и женщин в динамике длительных лыжных переходов в условиях высоких широт.

4. Изучить особенности изменений содержания апопротеинов A-I, В и Е в сыворотке крови крыс при действии на организм различных стрессовых факторов: холод, интенсивная физнагрузка, Еключая восстановительный период после нее.

5. Исследовать влияние адаптивных гормонов на синтез и секрецию апопротеина A-I гепатоцитами крыс в опытах in vitro.

Основные результаты исследования, их научная новизна.

Получены собственные антигены и антитела для тИФА апопротеинов A-I и В в биологических средах. Показана иммунохимичес-кая гетерогенность антигенов человека и крысы. Предложен новый способ химической обработки- сыворотки крови диметилсульфоксидом для более полного выявления антигенных детерминант апопротеина A-I (Авторское свидетельство II 1737340).

Впервые выявлены особенности изменения в крови содержания апопротеинов А-1 и В у людей в условиях высоких широт. Показано, что пол влиянием неблагоприятных условий окружающей среды формируются Факторы риска ИБС (снижение апо А-I и увеличение апопротеина В, уменьшение отношения апо А-1/апо В). У полярников Антарктиды впервые выявлена гипоапопротеинемия. Обнаружено изменение почечного барьера, для которого характерно появл^ни.-апопротеинов Л-I и В в моче. Экскреция апопротеинов усиливалась при физической нагрузке. Предложен способ количественной оценки этих нарушений по содержанию в моче белков с низкой (апо A-I) и

еысокой (апо В) молекулярной массой. Показано, что данный способ весьма информативен для оценки степени нарушения фихмрации и резбсорбции белков с различной молекулярной массой в почечных канальцах у больных с воспалительными заболеваниями почек.

Показано благоприятное влияние оптимального рациона по сравнению с углеводным на содержание апо Л-I и апо В б крови у людей, проживающих в условиях Заполярья. Острые воспалительные процессы являются важным обусловливающим фактором, влияющим у:\ содержание апо А-1 б крови.

Выявлена специфика изменений содержания and A-I, В и Е я пыропотк^ *р"ви у крыс под влиян::::.: фксичёс-юЛ нагрузки и холи-лоытп г>троса. с?ил^,?ТРЛ1>ст"уюмЗЛ с раскол роли зтих апопротеи-нов в развитии компенсаторно-приспособительных реакций организма.

В опытах in vitro на культуре гепатоцитов впервые показано, что гидрокортизон повышал синтез и секрецию апо A-I. Инсулин не оказывал влияния на продукцию этого белка, тогда как гидрокортизон с инсулином, добавленные вместе, увеличивали ее практически в 2.5 раза. Впервые обнаружено наличие апо A-I нм-муксреиктнг-.кости е хроматине гепатоцитов крнс. Содержание апо Д-г тр-іііскрппционно-актиБном хроматине и ядерном матрнкс? бч:,. выше, ч'-м jo фракциях суммарного и репресснроваккого хроматина

Те зрет_ическр_е значение работн заключается б изучении ро-о.'. газ-личных апопротеинов в развитии ксмпенсаторко-приепоесбито^у-мы:-: реа-ппй организма при действии на него чрезвычайных раяара-жителей.

Практическое значение работы состоит в оптимизации метода tK'JA. который дает возможность количественно определять содержание апопротеинов AI, В и Б в биологическом материале, включая к;>)ы>. мочу. ткани и клетки. Высокая чувствительность M^N';vr,a го звс-ляет определять апопротеини при содержании их в проба< '"-

Предложен новый способ химической обработки сыворотки крови, позволяющий одновременно определять количество апопротеинов А-1 и В в одних и тех же разведения*сыворотки крови.

.чаинки метод о успехом был применен нами дли оценки >" -нні!і! почечного (фильтрации и р^абеорбции бел-ха- . ; :„-

ЛИЧНОЙ Молекулярной МаСССЙ! Как " ЗДСрОЕЬІХ ЛЮДОЙ В усле'-!:^*

- б -

стресса, так и у больных с почечной патологией. Он позволяет обнаруживать их следовые количества, что особенно важно на ранних этапах развития почечной патологии. Определение алопротеи-нов в моче показывает, что в качестве критерия переносимости нагрузочных проб может быть использовано исследование содержания апопротеина А-І в моче.

Положения выдвигаемые на защиту: Г. Предложенный метод для иммуноферментного определения алопро-теиков пригоден для количественной оценки последних в сыворотке крови, моче, клетках, субклеточных структурах и другом биологическом материале. Метод может использоваться для решения как теоретических, так и клинических задач.

2. У человека под влиянием субэкстремальных и экстремальных факторов высоких широт изменяется соотношение в крови ало А-І и апо В: увеличение последнего сопровождается сдвигом липопротеи-нового спектра в сторону атерогенных форм ЛПНП и ЛПОНП с одновременным снижением апо А-І. Физическая нагрузка в этих же условиях увеличивает содержание апо А-І.

3. Существует специйика изменений содержания апопротеинов А-І, В и Е в крови животных, зависящая от особенностей действия на организм чрезвычайных раздражителей и которая свидетельствует о разной роли их в системе адаптационных сдвигов организма.

4. Инсулин потенциирует эй№ект гидрокортизона, связанный с усилением продукции апопротеина А-І гепатоцитами крыс в условиях in vt'ho.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 50-й итоговой научной конференции молодых ученых"Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины"(Новосибирск, 1909), Всесоюзной коніїеренции"Здоровье человека в Сибири"(Новосибирск, 1989), X Всесоюзном симпозиуме"Структура и Функции клеточного ядра (Гродно, 1990), 52-й научной конференции молодых ученых (Новосибирск, 1991), Школе-конйеренции молодых ученых"Механизмы повреждения и регуляции восстановительных процессов (Новосибирск, І99Г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ и получено авторское свидетельство № 1737340.

Объем работы, Диссертация написана на 179 страницах и состоит иа введения,- литературного обзора, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы (отечественных и иностранных источника). Работа содержит 23 таблицы и 22 рисунка.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института биохимки РАМН, номер государственной регистрации темы 056645.