Содержание к диссертации
Введение
РАЗДЕЛ 1. Обзор литературы... 14
1.1. Иммуноглобулины: структура и функции... 14
1.1.1. Полиспецифичность как одно из свойств естественных -глобулинов... 16
1.2. Влияние различных физико-химических факторов на структуру и функции иммуноглобулинов... 18
1.2.1. Влияние хаотропных ионов на антигенсвязывающие функции иммуноглобулинов... 20
1.2.2. Влияние экстремальных значений рН на антигенсвязывающие функции иммуноглобулинов... 23
1.2.3. Влияние металлов на конформационные изменения иммуноглобулинов... 25
1.2.4. Влияние мочевины на конформацию иммуноглобулинов по данным дифференциальной спектрофотометрии... 28
1.2.5. Механизмы усиления активности иммуноглобулинов in vivo. Влияние активных форм кислорода, органических растворителей и липаз на антигенсвязывающие функции иммуноглобулинов... 30
1.3. Механизмы, лежащие в основе полиреактивной трансформации иммуноглобулинов... 37
РАЗДЕЛ 2. Объекты, материал и методы исследований... 39
2.1. Материал исследования 39
2.2. Получение иммуноглобулиновой фракции... 40
2.3. Получение полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов ... 40
2.4. Электрофорез в полиакриламидном геле.
2.5. Твердофазный иммуноферментный анализ... 41
2.5.1. Взаимодействие антител с гликолипидными и белковыми антигенами... 41
2.5.2. Взаимодействие антител с денатурированной однонитевой и высокополимерной нативной ДНК... 42
2.5.3. Взаимодействие человеческого сывороточного альбумина с гликолипидными и белковыми антигенами... 43
2.5.4. Определение авидности антител... 44
2.5.5. Взаимодействие антител со стафилококковым белком А... 44
2.5.6. Конкурентное ингибирование гликолипидными и белковыми антигенами связывания антител с иммобилизованным липополисахаридом Escherichia coli K235... 45
2.5.7. Влияние обработки перйодатом натрия на взаимодействие антител с антигенами... 45
2.5.8. Влияние обработки боратом натрия на взаимодействие антител с антигенами ... 46
2.5.9. Вклад гидрофобных взаимодействий в связывание антител с антигенами... 47
2.5.10. Вклад электростатических взаимодействий в связывание антител с антигенами... 47
2.6. Ультрафиолетовая спектрофотометрия... 48
2.7. Коньюгирование... 49
2.7.1. Коньюгирование липополисахарида Escherichia coli K235 с флуоресцеинизотиоцианатом... 49
2.7.2. Коньюгирование суспензии Escherichia coli K30 и Staphilococcus aureus с флуоресцеинизотиоцианатом... 49
2.8. Проточная лазерная цитофлуориметрия...
2.8.1. Взаимодействие флуоресцентно меченного ЛПС с липополисахарид-связывающими рецепторами гранулоцитов и моноцитов периферической крови... 50
2.8.2. Определение фагоцитарной активности гранулоцитов периферической крови... 52
2.9. Люминол-зависимая хемилюминесценция... 53
РАЗДЕЛ 3. Результаты исследований... 55
3.1. Взаимодействие полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов с гликолипидными и белковыми антигенами, а также с денатурированной однонитевой и высокополимерной нативной ДНК... 55
3.2. Влияние Tween-20, хлорида натрия, а также высушивание антигена на взаимодействие полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов с гликолипидными и белковыми антигенами... 69
3.3. Влияние тиоцианата калия и мочевины на особенности трансформации и интенсивность взаимодействия полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов, а также человеческого сывороточного альбумина с гликолипидными и белковыми антигенами ... 75
3.4. Изучение биологической активности полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов... 81
3.5. Индивидуальныe особенности полиреактивной трансформации иммуноглобулинов в норме и при патологии... 90
Анализ и обобщение результатов исследования... 98
Выводы... 118
Практические рекомендации и внедрение результатов работы... 120
Перечень условных обозначений, символов, единиц, сокращений и терминов... 122
Список использованных источников... 125
- Влияние различных физико-химических факторов на структуру и функции иммуноглобулинов...
- Получение полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов
- Влияние обработки боратом натрия на взаимодействие антител с антигенами
- Влияние тиоцианата калия и мочевины на особенности трансформации и интенсивность взаимодействия полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов, а также человеческого сывороточного альбумина с гликолипидными и белковыми антигенами
Введение к работе
Актуальность проблемы. К настоящему времени установлена ведущая роль антитело-зависимых иммунных механизмов в защите организма человека от целого ряда инфекционных заболеваний бактериальной природы (Davies В. et al., 2011; Lopez-Collazo Е. et al, 2013; Esteban E. et al, 2013; Morris M.C. et al, 2015). В структуре возбудителей этих болезней важное место занимают условно-патогенные грамотрицательные энтеробактерии (Anwar М.А. et al., 2014; Putker F. et al., 2015). Ведущим фактором патогенности этих микроорганизмов является липополисахарид (ЛПС, эндотоксин), который обладает разнонаправленной биологической активностью и относится к числу наиболее мощных индукторов воспаления (Mohammadi Z., 2011; Morris M.C. et al., 2012; Zhang G. et al, 2013; Anwar M.A. et al, 2014; Rhee S.H., 2014; Schedlowski M. et al, 2014; Wyns H. et al., 2015). У больных с хирургической абдоминальной патологией ЛПС играет важную роль в развитии местных и системных воспалительных реакций, проявляющихся в виде нагноения раны, послеоперационной пневмонии, перитонита, сепсиса, полиорганной недостаточности (Мавзютов А.Р. и др., 2011; Дибиров М.Д. и др., 2012; Kohno Y. et al, 2013). При этом основной причиной попадания ЛПС в организм считается нарушение барьерной функции кишечника и усиление бактериальной транслокации (Sperandeo P. et al, 2009; Whitfield С. et al, 2014; Sang H.R., 2014; Putker F. et al., 2015). Попадая в кровь, ЛПС при участии липополисахарид-связывающего белка (LBP) взаимодействует с рецепторными мембранными белками клеток-мишеней (CD 14, MD2 и TLR-4) и формирует с ними гетеродимерный рецепторный комплекс, обеспечивающий трансдукцию сигнала. Обусловленная этим сигналом активация клеток-мишеней сопровождается синтезом провоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-ip и др.), а также целого ряда биоактивных медиаторов небелковой природы, включая активные формы кислорода (АФК) (Mussap М et al, 2011; Scior Т. et al, 2013; Bohannon J.K. et al., 2013; Park B.S. et al, 2013; Liaunardy-Jopeace A. et al, 2014; Sender V. et al, 2014; Plociennikowska A. et al., 2015). По данным литературы, в очагах воспаления in vivo АФК могут воздействовать на нативные иммуноглобулины класса G, вызывая значительные изменения их свойств. Одним из результатов такого воздействия является полиреактивная трансформация иммуноглобулинов, под которой понимается увеличение их способности к связыванию с самыми различными антигенами (Бобровник С. А., 1999). В системе in vitro полиреактивная трансформация иммуноглобулинов происходит в присутствии высоких концентрация хаотропных реагентов, к которым, в частности, относится тиоцианат калия (Бобровник С.А., 2004; Bouvet J.P. et al., 2001).
Взаимодействие полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов с различными модельными белками на сегодняшний день изучено достаточно хорошо (Бобровник С.А., 2002; Bouvet J.P. et al, 1998). Исследования, характеризующие взаимодействия полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов с ЛПС различных грамотрицательных энтеробактерии, до настоящего времени не проводились. Между тем оценка потенциальной роли
таких антител в нейтрализации биологической активности и клиренсе энтеробактериальных ЛПС представляет значительный интерес.
Цель работы: исследовать связывание полиреактивно
трансформированных иммуноглобулинов (ПРИГ), полученных в системе in vitro, с ЛПС некоторых видов грамотрицательных энтеробактерий, и оценить биологическую активность таких ПРИГ.
Задачи исследования.
-
Изучить связывание ПРИГ с ЛПС грамотрицательных энтеробактерий Escherichia coli К235, Salmonella Minnesota Re 595 и Salmonella enteritidis. Оценить вклад электростатических и гидрофобных взаимодействий во взаимодействии ПРИГ с ЛПС энтеробактерий Е. coli К235, S. Minnesota Re 595 и S. enteritidis.
-
Изучить влияние ПРИГ на поглотительную способность гранулоцитов периферической крови; на индуцированную зимозаном продукцию АФК нейтрофильными гранулоцитами; на ЛПС-связывающий потенциал гранулоцитов и моноцитов.
-
Сравнить способность к полиреактивной трансформации нативных иммуноглобулинов класса G, выделенных из сыворотки крови здоровых людей и больных с хирургической абдоминальной патологией (долихосигма, злокачественные новообразования).
Научная новизна. В работе охарактеризованы иммунобиологические свойства ПРИГ. Впервые показано, что предварительная обработка нативных иммуноглобулинов класса G тиоцианатом калия ведет к усилению их связывания с ЛПС энтеробактерий Е. coli К235, S. Minnesota Re 595 и S. enteritidis. Установлено, что основной вклад во взаимодействие ПРИГ с ЛПС энтеробактерий вносят электростатические связи, тогда как гидрофобные связи менее значимы.
Впервые установлено, что ПРИГ усиливают поглотительную способность гранулоцитов периферической крови по отношению к различным тест-объектам; повышают продукцию АФК нейтрофильными гранулоцитами при использовании в качестве корпускулярного стимула зимозана, опсонизированного ПРИГ; снижают связывание ЛПС энтеробактерий с гранулоцитами и моноцитами.
Впервые показано, что нативные иммуноглобулины класса G больных с хирургической абдоминальной патологией (долихосигма, злокачественные новообразования) подвержены полиреактивной трансформации в меньшей степени, чем нативные иммуноглобулины класса G здоровых людей.
Научная и практическая значимость. Результаты исследований
расширяют представления о вкладе ПРИГ в поддержание антигенного гомеостаза
организма. Разработан методический подход, позволяющий выявлять
индивидуальные особенности полиреактивной трансформации
иммуноглобулинов, что может быть использовано для характеристики изменений их свойств при различных патологических состояниях. Предложен метод оценки опсонизирующей активности ПРИГ с помощью проточной цитофлуориметрии. Разработан метод оценки влияния ПРИГ на взаимодействие ЛПС энтеробактерий
с ЛПС-связывающими рецепторами гранулоцитов и моноцитов периферической крови.
Основные научные положения, выносимые на защиту:
-
Кратковременная инкубация нативных иммуноглобулинов класса G в растворе тиоцианата калия, резко усиливает их связывание с ЛПС условно-патогенных энтеробактерий ЛПС Е. coli К235, S. Minnesota Re 595 и S. enteritidis.
-
В связывание ПРИГ с ЛПС Е. coli К235, S. Minnesota Re 595 и S. enteritidis основной вклад вносят электростатические взаимодействия.
-
ПРИГ усиливают поглотительную способность гранулоцитов периферической крови; повышают продукцию АФК нейтрофильными гранулоцитами и снижают уровень связывания ЛПС с гранулоцитами и моноцитами.
-
У больных с хирургической абдоминальной патологией нативные иммуноглобулины класса G в меньшей степени подвержены полиреактивной трансформации.
Апробация работы. Основные положения диссертации были освещены на: III международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и военно-морской медицины. Достижения, перспективы» (г. Севастополь, 2005 г.), IV открытой научно-практической конференции 2-го медицинского факультета ГУ «Крымский государственный медицинский университет имени СИ. Георгиевского» «Человек и микроорганизмы -параллельные миры», посвященная 70-летию со дня рождения профессора Ю.С Кривошеина (г. Симферополь, 2009 г.), VIII международной научно-практической конференции «Юбилейные Пироговские чтения», посвященные 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова (г. Севастополь, 2010 г.), научно-практической конференции ГУ «Крымский государственный медицинский университет имени СИ. Георгиевского» «Клиническая энд ото ксинол огия: итоги 10-летних достижений и дальнейшие перспективы (г. Симферополь, 2010 г.), открытой научно-практической конференции «Человек и микроорганизмы -параллельные миры», посвященная 125-летию со дня основания Института микробиологии и иммунологии имени И.И. Мечникова НАМИ Украины (г. Симферополь, 2012 г.), VI Конгрессе патофизиологов Украины «От экспериментальных исследований к клинической патофизиологии» (г. Ялта. Мисхор, 2012 г.).
Связь работы с научными программами, планами и темами. Диссертационная работа выполнена в рамках научно-исследовательских работ «Разработка и внедрение методов иммуноанализа липополисахаридов (эндотоксинов) грамотрицательных бактерий, антител к эндотоксинам и эндотоксин-связывающих рецепторов при инфекционной и неинфекционной патологии» (№ госрегистрации 0100U002155, шифр 2.116, срок выполнения 2000-2004 г.г.); «Разработка и внедрение методов диагностики состояния клеточного и гуморального антиэндотоксинового иммунитета в физиологии и патологии человека» (№ госрегистрации 0105U002205, шифр 02/1, срок выполнения 2005-2009 г.г.).
Публикации. По теме кандидатской диссертации опубликовано 8 научных статей, из них 5 - статьи в рецензируемых научных журналах, 1 статья в сборнике, 3 информационных письма, 6 материалов и тезисов докладов на научных конференциях.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 136 страницах печатного текста (119 страниц основного текста) и включает введение, обзор литературы, методы, результаты, обсуждение, выводы и практические рекомендации. Материал иллюстрирован 40 рисунками и 7 таблицами. Библиографический указатель содержит 181 источник.
Влияние различных физико-химических факторов на структуру и функции иммуноглобулинов...
Изучение ИГ является актуальной задачей современной иммунологии, особенно той ее части, в которой исследуются вопросы гуморального иммунитета. К настоящему времени установлена ведущая роль иммунных механизмов, реализуемых при непосредственном участие антител, в защите организма человека от целого ряда инфекционных заболеваний. Выяснение взаимосвязи между структурой и функцией ИГ, несомненно, важно как для расширения знаний о системе иммунитета, так и для создания нового подхода в диагностике [21, 30, 51, 54, 60, 66, 67, 136]. Антитела представляют собой сложно организованные высокомолекулярные гликопротеины, играющие чрезвычайно важное значение в защите организма человека и животных от инфекции [21, 51, 54]. ИГ синтезируются плазматическими клетками, предшественниками которых служат В-лимфоциты. Сами В-лимфоциты не секретируют антител, но распознают антигены с помощью мембранных ИГ, которые выполняют функцию антигенных рецепторов.
Плазматические клетки лишены рецепторов, но обретая мощные белок-синтезирующие и секреторные потенции, служат основным источником антител [34, 51, 72, 91, 103, 125, 153]. Основная (первичная) функция ИГ заключается в связывании самых разнообразных антигенов. Это предрасполагает к элиминации чужеродных объектов благодаря функциональной кооперации с клеточными (фагоциты, естественные киллеры, тучные клетки, эозинофилы) и гуморальными (комплемент) факторами врожденного иммунитета. Такие реакции формируются на основе лиганд-рецепторных взаимодействий, отражая вторичные (эффекторные) функции антител. Столь же неслучайны (т.е. рецепторзависимы) трансплацентарная передача ИГ и преодоление ими барьера слизистых оболочек [54, 80, 81, 92, 96, 107, 126, 130, 146, 147]. Молекула иммуноглобулинов класса G (IgG) представлена двумя парами идентичных легких (L) и тяжелых (Н) пептидных цепей, ковалентно соединенных дисульфидными связями (S-S-связи). Незащищенный шарнирный участок отличается высоким содержанием пролина, имеет протяженную структуру и доступен для протеолитических ферментов. Папаин расщепляет молекулу антитела на два одинаковых Fab-фрагмента, каждый из которых имеет один антигенсвязывающий центр и Fc-фрагмент, неспособный связывать антиген. В дополнение к S-S-связям, соединяющим L- и Н-цепи, существуют S-S-связи, за счет которых в пептидной цепочке образуются петли. Петли компактно свернуты и формируют глобулярные домены с характерной b-складчатой структурой. Каждая из цепей содержит по вариабельному (V) и константному (С) домену (в L-цепях – один V- и один С-домен; в Н-цепях – один V- и три С-домена). Вся глобула, напоминающая сэндвич, имеет гидрофобное ядро [20, 21, 30, 51, 60, 63, 66, 72, 93, 136, 150]. По данным рентгеноструктурного анализа, антигенсвязывающий центр молекулы ИГ представляет собой заполненную растворителем щель (полость), создаваемую поверхностями контакта VL- и VH-доменов, и несущую антигенсвязывающие участки; при этом глубина щели определяется пространственной конфигурацией комплементарного антигена. Предполагается, что вся антигенсвязывающая область образует своего рода пространственную мозаику из полиморфных сайтов связывания, которые взаимодействуют с различными антигенными детерминантами в пределах одного антигена [63, 150]. Изменение суммарного объема щели приводит к увеличению (или уменьшению) числа таких антигенсвязывающих участков. Последнее обстоятельство позволяет объяснить тот факт, что, несмотря на высокую специфичность молекул антител, к его активному центру могут присоединяться несколько отличающихся по структуре антигенов. Кроме того, такая “неспецифичность” антител, обусловленная наличием многих подцентров связывания и способностью щели к вариации, резко снижает количество ИГ, необходимых организму для иммунного ответа на огромное количество антигенов и, следовательно, уменьшает объем генетического материала, кодирующего VL- и VH-домены антигенраспознающих рецепторов на поверхности антител [20, 21, 51, 60, 63, 66, 72, 93, 150]. Таким образом, антигенсвязывающая область ИГ обладает исключительным разнообразием структурных вариантов, что создает основу для формирования гетерогенной популяции антител как биологических регуляторов. Различия в специфичности ИГ обусловлены очень небольшими изменениями их первичной структуры, благодаря которым разные участки активного центра, связываясь, становятся доступными для антигенов. Способность Fab-фрагмента взаимодействовать с несколькими антигенными детерминантами обеспечивает сохранение комплементарности к целому ряду не родственных антигенов [54, 80, 93, 130, 146, 147]. Согласно существующим представлениям, нативные-IgG-антитела рассматриваются как полифункциональные адаптерные молекулы, которые, с одной стороны, реагируют с антигеном с помощью специфических антигенсвязывающих центров, а с другой, реализуют эффекторные функции. К последним относятся активация системы комплемента и взаимодействие с рядом Fcg-рецепторов, приводящее к опсонизации чужеродных клеточных элементов. Fab- и Fc-сегменты ИГ не являются изолированными. Связывание антигена в активном центре, несомненно, сказывается на уровне эффекторных функций антител [63, 72, 93, 142, 147].
Характерной чертой многих видов естественных -глобулинов (еАт) является их полиспецифичность [83, 85, 86, 87, 88, 95, 102, 105, 129, 150]. Эта особенность была обнаружена при исследовании антител нормальной сыворотки, реагирующих с набором аутоантигенов: актином, тубулином, миоглобином, тиреоглобулином, фетуином, трансферрином, альбумином, коллагеном и цитохромом [98]. Несмотря на то, что ИГ были выделены с помощью аффинной хроматографии, практически все они реагировали с несколькими антигенами данной панели. В то же время индуцированные иммунизацией антитела к актину были узкоспецифичными и не взаимодействовали, например, с тубулином в отличие от е-анти-актиновых-антител. Это свидетельствует о том, что перекрестная реактивность еАТ обусловлена именно их полиспецифичностью, а не наличием общих эпитопов у перекрестно реагирующих антигенов (в данном случае актина и тубулина). Дальнейшие исследования, проведенные с моноклональными (мАт) и еАт, показали, что наблюдаемая полиспецифичность обусловлена не гетерогенностью популяции еАт, а присуща составляющим эту популяцию индивидуальным молекулам [86, 95, 98, 100].
Полиспецифичность в некоторой степени характерна для -глобулинов вообще, однако более всего она проявляется именно в случае еАт и аутоантител [99, 137, 141, 155, 156]. Так, например, антитела к ДНК у мышей аутоиммунных линий и у человека при системной красной волчанке, а также е-анти-ДНК-антитела обладают широкой полиспецифичностью, в то время как индивидуальные анти-ДНК-антитела (в данном случае для иммунизации используют или синтетические полинуклеотиды, или ДНК после облучения ультрафиолетом) оказываются узкоспецифичными [78, 89, 90, 109, 115, 116, 121, 149, 152]. Авторы считают, что полиспецифичность аутоантител, в частности анти-ДНК-антител, объясняется их структурными особенностями; высказано предположение, что активные центры этих ИГ содержат несколько гипервариабельных участков к различным антигенным детерминантам. Отмечено также и то, что при синтезе еАт и аутоантител используются немутированные эмбриональные гены, в то время как при иммунном ответе активируются мутированные гены [78, 94, 97, 108, 127, 156]. Возможно, существует причинная связь между полиспецифичностью еАт и аутоантител и тем, что они являются продуктами эмбриональных генов [72, 87, 128, 131, 149].
Считается, что полиспецифические еАт представляют собой эволюционно наиболее древний компонент системы гуморального иммунитета, которые, в отличие от специфических антиген-индуцированных антител, способны к непосредственному распознаванию и связыванию широкого спектра самых разных биологических молекул [99, 112, 123, 124, 129, 135, 137, 152]. Опосредованное полиспецифическими еАт первичное узнавание, с одной стороны, является эффекторной функцией создания барьера на пути чужеродных агентов, прежде всего бактерий и вирусов: антитело-зависимый лизис, осуществляемый киллерами или системой комплемента, вирус-нейтрализация, опсонизация и активация компонентов комплемента, вызывающих положительный хемотаксис макрофагов [112, 123, 135, 137, 151, 157, 158]. В то же время первичное узнавание можно квалифицировать и как индукторную функцию, поскольку осуществление перечисленных выше эффекторных реакций необходимо, главным образом, для стимуляции макрофагальной активности по отношению к инфекционным агентам и инициации “вторичного” узнавания, т.е. собственно иммунного ответа [54, 129, 137, 151, 158]. Следовательно, обеспечивая первую линию защиты организма против вторжения возбудителей инфекционного процесса, полиспецифические еАт могут служить важным дополнительным фактором иммунитета [54, 129, 137, 158]. Кроме того, в ряде исследований было высказано предположение, что одной из функций полиспецифических еАт является удаление стареющих клеток и продуктов их распада, а также транспортирование различных метаболитов [116]. Существует возможность образования полиспецифических еАт к эндогенным низкомолекулярным соединениям по антиидиотипическому механизму [14]. Однако потенциальная роль полиспецифических еАт в этих процессах пока остается неясной.
Получение полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов
Авидность антител определяли методом тиоцианатной элюции [132]. С этой целью, адсорбировавшиеся на иммуносорбенте ИГ элюировали возрастающими концентрациями (от 0 до 7 моль) тиоцианата аммония в течение 30 мин при 18С. В качестве антигена использовали коммерческие препараты ЛПС энтеробактерий E. coli K235, S. minnesota, S. enteritidis и ЛПС E. coli K12, выделенный из бактериальной биомассы методом одно-фенольной экстракции и дополнительно очищенный от примесей РНК обработкой цетавлоном (Serva, Германия) [19], а также ОвА. Образцы сыворотки крови больных с ХАП и ПРИГ разводили 1:200 PBS. Оценку ассоциированной с твердой фазой пероксидазной активности проводили по приведенной в разделе 2.5.1. схеме тИФА. Индекс авидности соответствовал молярной концентрации тиоцианата аммония, вызывающей 50 % уменьшение оптической плотности конечного продукта ферментативной реакции на заключительном этапе тИФА [132].
При проведении данного эксперимента нативные-IgG-антитела или ПРИГ с начальной концентрацией 10 мкг/мл (разводили с 2-кратным шагом PBS-NaN3) иммобилизировали в течение 12–18 часов при комнатной температуре (18–20С) на поверхности полистироловых планшетов. Для удаления неспецифически связавшихся компонентов и блокирования свободных центров связывания лунки промывали PBS-Т (4 раза по 1 мин). Затем в лунки вносили коньюгат белка А, меченного пероксидазой хрена (1:2000, белок А HRP, Пептос, Россия) и инкубировали в течение 60 мин при 37С. Оценку ассоциированной с твердой фазой пероксидазной активности проводили по приведенной в разделе 2.5.1. схеме тИФА.
Конкурентное ингибирование гликолипидными и белковыми антигенами связывания антител с иммобилизованным липополисахаридом Escherichia coli K235
При проведении данного эксперимента ЛПС E. coli K235 (10 мкг/мл) иммобилизовали как описано в разделе 2.5.1. Для удаления неспецифически связавшихся компонентов и блокирования свободных центров связывания лунки промывали (4 раза по 1 мин) PBS. Затем в лунки последовательно вносили смесь нативных-IgG-антител или ПРИГ (0,063 мг/мл) и соответствующего ингибирующего антигена (ЛПС энтеробактерий E. coli K235 или E. coli K30, E. coli K12, S. minnesota, S. enteritidis, а также ОвА и ds-ДНК) с начальной концентрацией 100 мкг/мл (разводили с 2-кратным шагом PBS); и коньюгата козьих аффинно очищенных антител к IgG человека с пероксидазой хрена (1:4000). Для разведения ингредиентов использовали PBS. С каждым реагентом проводили 60-минутную инкубацию при 37С. Оценку ассоциированной с твердой фазой пероксидазной активности проводили по приведенной в разделе 2.5.1. схеме тИФА. Полученные результаты конкурентного ингибирования связывания антител с ЛПС энтеробактерий E. coli K235, E. coli K30, E. coli K12, S. minnesota, S. enteritidis, а также ОвА и ds-ДНК выражали в процентах, при этом за 100 % принимали уровень связывания ИГ при минимальной концентрации конкурирующего антигена.
При проведении данного эксперимента ЛПС E. coli K235 или ЛПС S. minnesota, ЛПС S. enteritidis (10 мкг/мл) иммобилизовали как описано в разделе 2.5.1. После 3-кратной отмывки дистиллированной водой в лунки последовательно вносили по 100 мкл 0,25 моль водного раствора перйодата натрия и (после 3-кратной отмывки дистиллированной водой) 1 % раствор БСА (Sigma Сhem. Co., USA) в PBS-NaN3. С каждым реагентом проводили 30-минутную инкубацию при 37С. Для удаления несвязавшихся ингредиентов и блокирования альдегидных групп лунки промывали PBS (4 раза по 1 мин). Затем в лунки последовательно вносили по 100 мкл нативных-IgG-антител или ПРИГ с начальной концентрацией 25 мкг/мл (разводили с 2-кратным шагом PBS) и коньюгата козьих аффинно очищенных антител к IgG человека с пероксидазой хрена (1:4000). С каждым реагентом проводили 60-минутную инкубацию при 37С. Оценку ассоциированной с твердой фазой пероксидазной активности проводили по приведенной в разделе 2.5.1. схеме тИФА.
При проведении данного эксперимента ЛПС E. coli K235 или ЛПС S. minnesota, ЛПС S. enteritidis (10 мкг/мл) иммобилизовали как описано в разделе 2.5.1. Для удаления несвязавшегося ЛПС и блокирования свободных центров связывания лунки промывали PBS (4 раза по 1 мин). Затем в лунки последовательно вносили по 100 мкл 0,25 моль боратного буфера (рН 7,4); нативных-IgG-антител или ПРИГ с начальной концентрацией 100 мкг/мл (разводили с 2-кратным шагом PBS) и коньюгата козьих аффинно очищенных антител к IgG человека с пероксидазой хрена (1:4000). С каждым реагентом проводили 60-минутную инкубацию при 37С. Оценку ассоциированной с твердой фазой пероксидазной активности проводили по приведенной в разделе 2.5.1. схеме тИФА.
При проведении данного эксперимента ЛПС E. coli K235 и ОвА (10 мкг/мл) иммобилизовали как описано в разделе 2.5.1. Для удаления неспецифически связавшихся компонентов и блокирования свободных центров связывания лунки промывали (4 раза по 1 мин) PBS. Для разведения антител использовали PBS, который содержал убывающие в геометрической прогрессии концентрации Tween-20 (от 0,2 % до 0,003 %). В лунки полистироловых планшетов последовательно вносили по 100 мкл нативных-IgG-антител или ПРИГ (100 мкг/мл) в PBS, содержащем различные концентрации Tween-20 и инкубировали в течение 60 мин при 37С. В качестве контроля использовали PBS. После отмывки неспецифически связавшихся компонентов в лунки вносили по 100 мкл коньюгата козьих аффинно очищенных антител к IgG человека с пероксидазой хрена (1:4000) и снова инкубировали 60 мин при 37С. Оценку ассоциированной с твердой фазой пероксидазной активности проводили по приведенной в разделе 2.5.1. схеме тИФА.
Взаимодействие антител с ОвА (10 мкг/мл), иммобилизованным на поверхности твердой фазы путем высушивания в течение 12–18 часов при 37С и сорбцией из буфера для иммобилизации (PBS-NaN3) без стадии высушивания в течение 60 мин при 37С оценивали методом тИФА по приведенной в разделе 2.5.1. схеме.
При проведении данного эксперимента ЛПС E. coli K235 и ОвА (10 мкг/мл) иммобилизовали как описано в разделе 2.5.1. Для удаления неспецифически связавшихся компонентов и блокирования свободных центров связывания лунки промывали (4 раза по 1 мин) PBS. Для разведения антител использовали PBS, который содержал убывающие в геометрической прогрессии концентрации NaCl (от 1 моль до 0,02 моль). В лунки полистироловых планшетов последовательно вносили по 100 мкл нативных-IgG-антител или ПРИГ (100 мкг/мл) в PBS-Т, содержащем различные концентрации NaCl и инкубировали в течение 60 мин при 37С. В качестве контроля использовали PBS, не содержащий NaCl. После отмывки неспецифически связавшихся компонентов в лунки вносили по 100 мкл коньюгата козьих аффинно очищенных антител к IgG человека с пероксидазой хрена (1:4000) и снова инкубировали 60 мин при 37С. Оценку ассоциированной с твердой фазой пероксидазной активности проводили по приведенной в разделе 2.5.1. схеме тИФА.
Все эксперименты выполняли в 3-кратной повторности. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью Microsoft Excel 97 из пакета Microsoft Office 97. Каждая точка кривых на рисунках, приведенных в разделе “Результаты и обсуждение”, представляет собой среднее значение, полученное из 3 параллельных опытов. Для графического представления результатов данные сглаживали по методу трех точек [33]. При этом относительная величина стандартной ошибки не превышает 7 % от среднего значения измеряемого показателя.
Влияние обработки боратом натрия на взаимодействие антител с антигенами
Так, при максимальной концентрации (100 мкг/мл) ПРИГ и нативных-IgG-антител в ИС уровень связывания с ОвА, иммобилизованным на поверхности твердой фазы путем высушивания, был соответственно 0,673±0,005 и 0,081±0,002 усл. ед. оп. плотности; с ОвА, сорбированным из буфера для иммобилизации без стадии высушивания – соответственно 0,917±0,006 и 0,092±0,002 усл. ед. оп. плотности. Наряду с этим установлено, что убывающие в геометрической прогрессии концентрации NaCl (от 1 моль до 0,02 моль) в ИС существенно влияют на связывание ПРИГ и нативных-IgG-антител с ЛПС E. coli K235 (Рис. 3.2.5.) и ОвА (Рис. 3.2.6.). Так, при максимальной (1 моль) концентрации NaCl в ИС связывание ПРИГ с ЛПС E. coli K235 и ОвА снижалось соответственно в 8,0 раза и 7,0 раза по сравнению с аналогичными значениями при минимальной (0,02 моль) концентрации NaCl в ИС, и соответственно в 9,5 раза и 7,9 раза по отношению к величине данного показателя для ИС, не содержащей NaCl.
Связывание нативных-IgG-антител с ЛПС E. coli K235 и ОвА при максимальной (1 моль) концентрации NaCl в ИС снижалось соответственно в 4,2 раза и 2,7 раза по сравнению с аналогичными значениями при минимальной (0,02 моль) концентрации NaCl в ИС, и соответственно в 6,3 раза и 3,4 раза по отношению к величине данного показателя для ИС, не содержащей NaCl. При этом по сравнению с нативными-IgG-антителами концентрация NaCl в ИС влияет на уровень связывания ПРИГ с указанными антигенами в существенно большей степени, что, по-видимому, обусловлено более низкой аффинностью ПРИГ. При максимальной концентрации NaCl (1 моль) в ИС уровень связывания ПРИГ и нативных-IgG-антител с ЛПC E. coli K235 был соответственно 0,119±0,004 и 0,070±0,002 усл. ед. оп. плотности; с ОвА – 0,200±0,003 и 0,100±0,002 усл. ед. оп. плотности. При минимальной концентрации NaCl (0,02 моль) в ИС уровень связывания ПРИГ и нативных-IgG-антител с ЛПC E. coli K235 был соответственно 0,950±0,002 и 0,291±0,002 усл. ед. оп. плотности; с ОвА – 1,409±0,005 и 0,265±0,002 усл. ед. оп. плотности. Для ИС, не содержащей NaCl, уровень связывания ПРИГ и нативных-IgG-антител с ЛПC E. coli K235 был соответственно 1,119±0,002 и 0,473±0,002 усл. ед. оп. плотности; с ОвА – 1,570±0,002 и 0,352±0,002 усл. ед. оп. плотности.
Влияние тиоцианата калия и мочевины на особенности трансформации и интенсивность взаимодействия полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов, а также человеческого сывороточного альбумина с гликолипидными и белковыми антигенами
Известно, что воздействие на нативные-IgG-антитела того или иного дестабилизирующего фактора ведет к значительному усилению их способности связываться с самыми разными биологическими молекулами [6, 10, 50, 87, 120]. Однако механизмы, лежащие в основе полиреактивной трансформации антител остаются недостаточно изученными. Предполагается, что трансформация нативных-IgG-антител в ПРИГ сопровождается увеличением подвижности субдоменных структур центров связывания антител, что позволяет им легко изменять конформацию Fab-участков для подстройки под структуру различных антигенных эпитопов [8, 9, 12, 13, 36]. Не исключено, что полиреактивная трансформация обусловлена частичной денатурацией ИГ, которая приводит к появлению нового конформационного состояния белковой молекулы, в результате чего на поверхности антител экспонируется дополнительное количество гидрофобных сайтов, существенно повышающих вероятность неспецифического взаимодействия образующихся ПРИГ с широким спектром антигенов [3, 8, 9]. Кроме того, существует мнение, что в антигенсвязывающих центрах -глобулинов присутствуют сохранившиеся в ходе эволюции “предковые” сайты связывания, наличие которых и определяет сам феномен полиреактивности [72, 87, 88]. В соответствии с одной из представленных выше гипотез, потенциально не только ИГ, но и любой другой частично денатурированный белок может приобретать способность к неспецифическому взаимодействию с самими разнообразными лигандами. В связи с этим возникает вопрос – могут ли какие-либо другие белки (например, человеческий сывороточный альбумин) в результате экспозиции с 3,5 моль тиоцианатом калия приобретать полиреактивные свойства или же полиреактивная трансформация под воздействием того или иного дестабилизирующего фактора характерна только для молекул антител? Целью данного подраздела являлась экспериментальная проверка такого предположения.
Из полученных результатов следует, что полиреактивная трансформации антител не может быть сведена к простой денатурации молекулы ИГ, на что указывают следующие обстоятельства. Установлено, что показатели, характеризующие интенсивность взаимодействия -глобулинов с ЛПС E. coli K235 (Рис. 3.3.1.), ЛПС S. minnesota (Рис. 3.3.2.), ЛПС S. enteritidis (Рис. 3.3.3.) и ОвА (Рис. 3.3.4.) после воздействия на них 1 моль и 3,5 моль мочевиной, практически не отличалась от таковых для нативных-IgG-антител. В тоже время 10-минутная инкубация нативных-IgG-антител с 3,5 моль тиоцианатом калия приводит к полиреактивной трансформации антител, что проявляется в многократном усилении их взаимодействия с выше указанными антигенами.
Влияние тиоцианата калия и мочевины на особенности трансформации и интенсивность взаимодействия полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов, а также человеческого сывороточного альбумина с гликолипидными и белковыми антигенами
Как известно, на авидность антител существенно влияет характер их взаимодействия с различными антигенными эпитопами [63, 132]. В связи с этим нами была проведена серия экспериментов по конкурентному ингибированию связывания гликолипидными и белковыми антигенами, а также ds-ДНК ПРИГ и нативных-IgG-антител с иммобилизованным ЛПС E. coli K235 (подраздел 3.1., Рис. 3.1.13., Рис. 3.1.14. и Рис. 3.1.15.). Оказалось, что присутствующие в растворе ЛПС энтеробактерий E. coli K235, E. coli K30, E. coli K12, S. minnesota, S. enteritidis, а также ОвА и ds-ДНК в разной степени влияют на взаимодействие антител с ЛПС E. coli K235, иммобилизованном на поверхности твердой фазы. В соответствии с полученными нами данными, даже при достаточно высокой концентрации, указанные антигены не оказывают существенного влияния на связывание ПРИГ с иммобилизованным ЛПС E. coli K235. По всей видимости, это определяется тем, что авидность ПРИГ к солюбилизированным антигенам существенно ниже, чем к антигену, иммобилизованному на поверхности твердой фазы.
В публикациях некоторых авторов высказывается мнение, что трансформация нативных-IgG-антител в ПРИГ сопровождается резким усилением роли гидрофобных взаимодействий в процессах межбелкового комплексообразования. Так, Бобровником С.А., а также другими авторами было показано, что ПРИГ более эффективно реагируют с белковыми антигенами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы путем высушивания из аммоний-бикарбонатного буфера [8, 9, 12, 13, 113]. Авторы цитируемых работ связывают наблюдаемый эффект с тем, что при высушивании нативная конформация белков-антигенов нарушается и на их поверхности появляются ранее экранированные гидрофобные сайты, что и обеспечивает формирование новых антигенных детерминант, распознаваемых ПРИГ. Однако, выполненные нами исследования по изучению особенностей реагирования ПРИГ с ЛПС энтеробактерий E. coli K235, S. minnesota и S. enteritidis, а также с ОвА, проводились в присутствии достаточно высокой концентрации (0,05 %) неионного детергента Tween-20, который, как известно, достаточно эффективно блокирует межбелковые гидрофобные взаимодействия. В связи с этим вклад гидрофобных связей в реализацию механизмов взаимодействия ПРИГ с соответствующими лигандами представляется незначительным. Дальнейшие эксперименты, направленные на сравнительный анализ влияния концентрации Tween-20 и NaCl в ИС на взаимодействие ПРИГ и нативных-IgG-антител с ЛПС E. coli K235 и ОвА, подтвердили это предположение. Действительно, убывающие в геометрической прогрессии концентрации Tween-20 (от 0,2 % до 0,003 %) в ИС практически не влияли на связывание антител с вышеуказанными антигенами (подраздел 3.2., Рис. 3.2.1. и Рис. 3.2.2.). Кроме того, уровень связывания ПРИГ с ОвА, иммобилизованным на поверхности твердой фазы путем высушивания, был заметно ниже, чем с ОвА, не подвергшемуся после иммобилизации высушиванию, тогда как для нативных-IgG-антител такой эффект практически отсутствовал (подраздел 3.2., Рис. 3.2.3. и Рис. 3.2.4.). В то же время реакционная способность ПРИГ и нативных-IgG-антител относительно ЛПС энтеробактерий E. coli K235, S. minnesota и S. enteritidis, а также с ОвА существенно зависела от концентрации NaCl в ИС (подраздел 3.2., Рис. 3.2.5. и Рис. 3.2.6.). При этом по сравнению с нативными-IgG-антителами концентрация NaCl в ИС влияет на уровень связывания ПРИГ с указанными антигенами в существенно большей степени, что, по-видимому, обусловлено более низкой авидностью ПРИГ. По данным рентгеноструктурного анализа миелоидных белков антигенсвязывающий центр молекулы антител представляет собой полость, образованную пептидными петлями, содержащими гипервариабенльные участки L- и Н-цепей, соединенных S-S-связями. Петли компактно свернуты и формируют глобулярные домены с характерной антипараллельной -складчатой структурой. Пространство между -слоями заполнено боковыми цепями гидрофобных аминокислотных остатков, обращенных внутрь домена и образующих кластерные структуры. Известно, что хаотропные ионы нарушают упорядоченную структуру воды, что ведет к ослаблению гидрофобных взаимодействий между белковыми молекулами и их доменами в водных растворах [63, 150]. По-видимому, ослабление гидрофобных взаимодействий между VL- и VH-доменами, а также между другими доменными структурами L- или Н-цепей, вызванное воздействием, используемого в наших экспериментах по полиреактивной трансформации 3,5 моль тиоцианат калия, способствует снижению жесткости молекулы антитела. Вероятно, это сопровождается раздвижением V-областей L- и Н-цепей, что в свою очередь ведет к увеличению глубины и ширины антигенсвязывающей щели и обнажению новых антигенсвязывающих участков. Вместе с тем релаксация к нативной конформации после удаления хаотропного агента происходит достаточно медленно. В результате антитело становится полиреактивным. При этом увеличение количества низкоаффинных антигенсвязывающих центров при определенных условиях, в частности, при контакте с полисахаридами, несущими периодически повторяющиеся антигенные детерминанты, повышает вероятность многоточечного связывания и может приводить к необратимой сорбции. Подобные эффекты часто наблюдаются при адсорбционной хроматографии, когда из-за многоточечных контактов фракционируемое вещество очень прочно, а иногда и необратимо связывается с сорбентом [57]. Косвенным подтверждением этого предположения могут служить результаты наших экспериментов, которые продемонстрировали, что эффект необратимого связывания ПРИГ наблюдался по отношению к ЛПС энтеробактерий E. coli K235, E. coli K12 и S. enteritidis, в молекулах которых О-полисахаридная цепь представлена в полном объеме.
Из полученных нами результатов следует, что полиреактивная трансформация антител под воздействием того или иного дестабилизирующего фактора не может быть сведена к простой денатурации молекулы ИГ, на что указывают следующие обстоятельства. Непродолжительная (в течение 10 мин) инкубация нативных-IgG-антител в присутствии 1 моль и 3,5 моль концентраций такого хорошо известного денатурирующего агента, как мочевина, сопровождается существенным снижением интенсивности их поглощения в диапазоне длин волн 240–300 нм по сравнению с аналогичными значениями оптической плотности для нативных-IgG-антител это указывает на выраженную денатурацию молекул антител, однако не сопровождается усилением взаимодействия таких денатурированных ИГ с ЛПС энтеробактерий E. coli K235, S. minnesota и S. enteritidis, а также ОвА. В тоже время, аналогичная по времени экспозиция нативных-IgG-антител с 3,5 моль тиоцианатом калия не вызывает существенных изменений их экстинкции в ультрафиолетовой области спектра (240–300 нм), но ведет к полиреактивной трансформации (подраздел 3.3., Рис. 3.3.1. – 3.3.5.). Полученные нами данные спектральных исследований свидетельствуют о том, что воздействие на нативные-IgG-антитела 1 моль и 3,5 моль мочевиной сопровождается полной или частичной потерей контакта хромофорных групп с окружающими их соседними группами в молекуле белка и их переходом в окружение, создаваемое растворителем. В результате в водную среду высвобождается часть аминокислот и углеводов, локализованных в междоменной области -глобулина [3, 28, 65]. В то же время экспозиция антител с 3,5 моль тиоцианатом калия не вызывает существенных изменений спектральных свойств их хромофорных групп. По всей видимости, обнаруженные различия в особенностях структурной пертурбации нативных-IgG-антител при взаимодействии с выше указанными физико-химическими факторами способны ощутимо влиять на их функциональные свойства. Кроме того, экспериментальная проверка показала, что полиреактивная трансформация является особенностью, характерной, по-видимому, только для молекул антител, поскольку такая же по времени инкубация ЧСА с 3,5 моль тиоцианатом калия не оказывает влияния на его способность связываться с различными антигенами (подраздел 3.3., Рис. 3.3.6.). Кроме того, интенсивность взаимодействия ЧСА-KSCN с ЛПС S. minnesota и ЛПС S. enteritidis была заметно ниже по сравнению с аналогичными значениями для такой же концентрации исходного препарата ЧСА и практически не отличалась для ЛПС E. coli K235 и ОвА. Известно, что ЛПС состоит из проксимальной гидрофобной липидной части, получившей название липид А, и дистального гидрофильного компонента, включающего в себя О-специфическую полисахаридную цепь и олигосахаридный кор. Гидрофобная часть липида А содержит от 5 до 7 насыщенных жирных кислот (ЖК), включая 3-оксикарбоновые, которые присоединены к углеводородному скелету сложноэфирными и амидными связями [17, 38, 39, 84, 106, 134]. Поскольку важной функциональной особенностью ЧСА является способность связывать и транспортировать ряд веществ эндогенного происхождения, в том числе ЖК [1, 62, 110, 111, 140], можно полагать, что остатки ЖК в составе липида А могут взаимодействовать с соответствующими сайтами связывания ЧСА [111]. Указанное обстоятельство, по всей видимости, является главной причиной обнаруженного нами повышенного уровня связывания ЧСА с ЛПС отдельных видов энтеробактерий. Несмотря на то, что липид А характеризуется высоким консерватизмом строения, жирнокислотный состав для каждого конкретного вида энтеробактерий может заметно различаться по типу ЖК, длиной их цепи и местом присоединения [17, 38, 39]. Известно, что гидрофильная основа липида А ацетилирована четырьмя остатками (R)-3-гидроксимиристиновой кислоты (3-ОН-С14:О), гидроксильные группы которых могут нести разные ацильные заместители. Так, например, в липиде А Escherichia coli гидроксильные группы 3-ОН-С14:О замещены лауриновой кислотой (С12:0) или не имеют заместителя (R-Н), а в липиде А Salmonellа – пальмитиновой кислотой (С16:0) [38]. Наряду с этим установлено, что на молекуле ЧСА имеются сайты связывания, обладающие неодинаковым сродством к ЖК с различной длиной алкильной группы [110, 111, 140].