Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. История открытия и молекулярная структура цисплатина 13
1.2. Метаболизм цисплатина в клетке. Биохимические основы цитостатического действия цисплатина 14
1.2.1. Внутриклеточный транспорт и метаболизм цисплатина .14
1.2.2. Механизмы внутриклеточного ответа на повреждение ДНК, вызванное цисплатином 16
1.2.3. Репарация повреждений ДНК, вызванных цисплатином 16
1.2.4. Нарушения клеточного цикла и индукция апоптоза 19
1.3. Применение цисплатина в химиотерапии онкологических заболеваний и проблема резистентности .21
1.3.1. Биохимические и молекулярно-биологические механизмы развития устойчивости к цисплатину и пути ее преодоления 22
1.4. Биоинформатические подходы к идентификации генов человека, связанных с определенными биологические функциями в клетке 27
1.4.1. Эволюционная и сравнительная геномика, понятия ортолог и паралог .27
1.4.2. Биоинформатические подходы к идентификации ортологов и оценке эволюционных взаимодействий между генами 30
Глава 2. Материалы и методы 32
2.1. Биоинформатические методы 32
2.1.1. Биоинформатический анализ баз данных модельных организмов .32
2.1.2. Методы идентификации ортологов эволюционно консервативных генов-кандидатов 32
2.1.3. Кластеризация и визуализация данных скриннинговых исследований .33
2.1.4. Функциональная аннотация генов 33
2.1.5. Анализ мутационного профиля использованных клеточных линий 34
2.2. Объекты исследования in vitro. Методы работы с эукариотическими клеткам 34
2.2.1. Клеточные линии и культивирование эукариотических клеток 34
2.2.2. Метод химической трансфекции эукариотических клеток миРНК .35
2.3. Оптические методы анализа 37
2.3.1. Анализ выживаемости клеток методом количественной флуориметрии 37
2.3.2. Анализ количества фокусов репарации методом иммунофлуоресцентной микроск 39
2.4. Анализ экспрессии мРНК методом ПЦР в реальном времени .40
2.5. Анализ экспрессии белка методом иммуноблотинга 42
2.5.1. Получение клеточных лизатов 42
2.5.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 43
2.5.3. Белковый перенос на PVDF мембрану, детекция и анализ 43
Глава 3. Результаты исследований 45
3.1. Поиск эволюционно консервативных генов кандидатов, вовлеченных в клеточный ответ на повреждение ДНК, с помощью модельных организмов 45
3.1.1. Идентификация генов-кандидатов в S. cerevisiae 45
3.1.2. Кластеризация генов S. cerevisiae со схожим профилем чувствительности к лекарственным веществам 49
3.1.3. Идентификация генов-кандидатов в D.melanogaster и C.elegans 56
3.2. Идентификация человеческих ортологов найденных генов кандидатов 58
3.3 Влияние снижения экспрессии обнаруженных генов-кандидатов на чувствительность к цисплатину и другим химиотерапевтическим препаратам в клетках опухоли головы и шеи и рака яичника 60
3.4. Характеристика молекулярных механизмов сенситизации к цисплатину: оценка индукции фокусов репарации и уровня фосфорилирования киназы ATR 66
3.4.1. Влияние снижения экспрессии генов-кандидатов на количества фокусов репарации повреждений ДНК, вызванных цисплатином 66
3.4.2. Влияние снижения экспрессии генов-кандидатов на уровень фосфорилирования киназы ATR - активатора фосфорилирования Н2АХ 70
3.5. Оценка роли потенциальных маркеров RAD50 и SMARCA5 в регуляции чувствительности к цисплатину и другим химиотерапевтическим препаратам в клетках опухоли головы и шеи и рака яичника 72
3.6. Влияние нокдауна генов RAD50 и SMARCA5 на фосфорилирование гистонового белка H2AX в клетках опухоли головы и шеи и рака яичника .74
Глава 4. Обсуждение результатов .76
Выводы .82
Список сокращений 83
Список литературы 86
- Биохимические и молекулярно-биологические механизмы развития устойчивости к цисплатину и пути ее преодоления
- Идентификация генов-кандидатов в S. cerevisiae
- Влияние снижения экспрессии обнаруженных генов-кандидатов на чувствительность к цисплатину и другим химиотерапевтическим препаратам в клетках опухоли головы и шеи и рака яичника
- Влияние снижения экспрессии генов-кандидатов на количества фокусов репарации повреждений ДНК, вызванных цисплатином
Введение к работе
Актуальность проблемы. Применение соединений платины, таких
как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин, лежит в основе
противоопухолевой химиотерапии многих видов рака, включая рак
яичника (РЯ), легкого, желудка, шейки матки, а также колоректальный рак
и злокачественные опухоли головы и шеи. Цитотоксическое действие
препаратов платины реализуется преимущественно за счет повреждения
структуры ДНК вследствие формирования поперечных ковалентных
сшивок, что ведет к блокированию клеточного цикла при переходе из S
фазы в G2, а также запуску клеточной программы репарации повреждений
ДНК. В случае большого количества нерепарируемых повреждений, а
также избыточного оксидативного стресса, активируются
специализированные сигнальные пути, ответственные за
программированную гибель клетки.
Первичная и приобретенная устойчивость опухолей к цитотоксическому действию цисплатина является одной из важнейших проблем в современной онкологии и главным фактором, ограничивающим эффективность его применения в терапии. Например, более 70% пациенток с РЯ исходно демонстрируют положительный ответ на терапию цисплатином, однако данный эффект непродолжителен, а пятилетняя выживаемость составляет лишь 15-20% из-за приобретения опухолью устойчивости к действию цисплатина. Для опухолей головы и шеи приобретенная в ходе циклов химиотерапии резистентность к цисплатину является главным фактором рецидива заболевания и осложнения дальнейшей терапии, поскольку требует увеличения дозы цисплатина, что сопряжено с повышением токсичности терапии и нежелательными побочными эффектами. Более того, развитие устойчивости к цисплатину ассоциировано с развитием у клеток опухоли множественной резистентности и к другим противоопухолевым препаратам, что сильно
ограничивает терапевтические подходы и значительно осложняет лечение таких пациентов в случае рецидива.
Mолекулярные механизмы устойчивости к цисплатину не до конца изучены, однако известна их связь с сигнальными путями, активирующимися в ответ на повреждение ДНК (DDR - DNA Damage Response). Несмотря на то, что уже описаны некоторые молекулярные механизмы, обуславливающие развитие устойчивости к действию цисплатина и найден ряд маркеров, ассоциированных с резистентностью, проблема ее преодоления остается нерешенной. Дальнейшее изучение механизмов развития резистентности и обнаружение новых генов, регулирующих чувствительность опухолей к цисплатину, необходимо для разработки новых терапевтических подходов к лечению онкологических заболеваний, увеличения эффективности применения уже существующих химиотерапевтических препаратов, а также поиска новых предиктивных маркеров ответа на противоопухолевую терапию.
Таким образом, актуальность проблемы состоит в высокой частоте случаев первичной и приобретенной устойчивости к цисплатину для многих видов рака, сопряженной с негативным прогнозом развития заболевания и низкой выживаемостью, а также в отсутствие эффективных терапевтических подходов к ее преодолению. Понимание молекулярных механизмов ответа на действие химиопрепаратов, вызывающих повреждение ДНК, в контексте действия цисплатина поможет понять причины возникновения и развития устойчивости, а также в выявлении новых маркеров чувствительности к цисплатину и новых мишеней для комбинированной химиотерапии.
Цель настоящей работы – идентифицировать новые молекулярно-биологические маркеры, регулирующие чувствительность опухолевых клеток человека к действию цисплатина, и выявить возможные молекулярные механизмы этой регуляции.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие научные задачи:
-
Выявить гены дрожжей, регулирующие ответ клетки на повреждения ДНК и чувствительность к цисплатину, и определить среди них человеческие ортологи, которые ранее не были охарактеризованы в качестве регуляторов чувствительности к цисплатину.
-
Оценить роль идентифицированных генов в регуляции чувствительности к цисплатину и другим химиотерапевтическим препаратам в клеточных линиях плоскоклеточной карциномы головы и шеи и рака яичника.
-
Изучить влияние генов, регулирующих чувствительность к цисплатину, на фосфорилирование гистонового белка H2AX (H2A Histone Family Member X) и активацию киназы ATR (Ataxia Telangiectasia and Rad3-related protein).
-
Выявить уровень экспрессии и наличие амплификаций в обнаруженных генах, регулирующих чувствительность к цисплатину, в опухолевых образцах пациентов с раком яичника и плоскоклеточной карциномой головы и шеи.
-
Оценить роль потенциальных предиктивных маркеров RAD50 и SMARCA5 в регуляции чувствительности к цисплатину и их влияние на фосфорилирование гистонового белка H2AX в клеточных линиях плоскоклеточной карциномы головы и шеи и рака яичника.
Научная новизна. В данной работе был впервые применен биоинформатический подход к поиску новых генов, регулирующих чувствительность к цисплатину в клетках человека. Для этого был проведен масштабный биоинформатический анализ опубликованных данных о генах S. cerevisiae, участвующих в регуляции чувствительности клеток к цисплатину и радиации, который позволил определить список ортологов человека, потенциально вовлеченных в ответ на повреждение
6 ДНК и регуляцию чувствительности к цисплатину в клетках человека.
В ходе экспериментов было идентифицировано 6 генов (WDHD1, RAD54L, CSNK2B, UBE2V2, POLR2I и DSCC1), для которых впервые показано, что они регулируют чувствительность опухолевых клеток к цисплатину и другим ДНК-повреждающим химиотерапевтическим средствам (5-фторурацил (5-ФУ) и олапариб), применяемым в терапии онкологических заболеваний. Кроме того, впервые было показано, что нокдаун генов POLR2I, RAD54L и WDHD1 сам по себе значительно снижает жизнеспособность клеток рака головы и шеи и РЯ.
Впервые показан молекулярный механизм увеличения чувствительности клеток опухолевых клеточных линий к цисплатину с участием генов WDHD1, RAD54L, CSNK2B, UBE2V2, POLR2I и DSCC1. Было обнаружено, что нокдаун генов WDHD1, RAD54L, CSNK2B, UBE2V2, POLR2I и DSCC1 связан с дефектом ответа на повреждение ДНК, которое заключается в снижении фосфорилирования гистонового белка H2AX. Данный эффект, в свою очередь, связан со снижением экспрессии активной фосфорилированной формы киназы ATR, что ведет к снижению количества фокусов репарации ДНК и повышению чувствительности клеток к повреждающему действию цисплатина.
Для генов POLR2I и CSNK2B (ортологи S.cerevisiae RPB9 и CKB2 соответственно) связь с системой репарации ДНК в клетках человека ранее не была где-либо аннотирована.
Анализ данных экспрессии генов в опухолевых образцах пациентов с плоскоклеточной карциномой головы и шеи и РЯ показал наличие амплификации и/или повышенной экспрессии идентифицированных генов в значительной части образцов, что подтверждает их важность в патогенезе данных типов рака.
Впервые была показана роль генов RAD50 и SMARCA5, играющих важную роль в процессах репарации, и которые уже охарактеризованы как
маркеры устойчивости к цисплатину при раке молочной железы, в регуляции жизнеспособности клеток опухолей головы и шеи и рака яичника. Была обнаружена роль данных генов в регуляции чувствительности опухолевых клеток к цисплатину и другим химиотерапевтическим ДНК повреждающим препаратам, применяемым в лечении опухолей головы и шеи и рака яичника. Показано, что нокдаун генов RAD50 и SMARCA5 значительно увеличивал чувствительность клеток данных опухолей к цисплатину, 5-ФУ и олапарибу. Также была продемонстрирована роль гена SMARCA5 в регуляции базового уровня фосфорилирования H2AX.
Научно-практическая значимость работы. Цисплатин является одним из распространенных химиотерапевтических препаратов, применяемых в терапии различных видов рака. Понимание молекулярно-клеточных механизмов, лежащих в основе развития устойчивости к цисплатину, является очень важным для разработки новых подходов к ее преодолению.
Обнаруженные в ходе данного исследования гены WDHD1, RAD54L, CSNK2B, UBE2V2, POLR2I и DSCC1 являются новыми потенциальными терапевтическими мишенями в лечении и предиктивными маркерами ответа на терапию цисплатином у пациентов с опухолями головы и шеи и РЯ. Кроме того, описанные механизмы влияния данных генов на сигнальные пути процессов репарации, связанных с повреждением ДНК, расширяют понимание фундаментальных основ внутриклеточного сигнального ответа, связанного с повреждением ДНК.
Показанная нами роль генов RAD50 и SMARCA5 в контексте жизнеспособности и чувствительности опухолевых клеток рака головы и шеи и РЯ к химиотерапии также характеризует их в качестве потенциальных предиктивных маркеров ответа на терапию в данных типах рака.
Таким образом, полученные данные представляют практический интерес для клинической онкологии и фармакологии, а также для фундаментальной молекулярной биологии и биохимии.
Положения, выносимые на защиту:
-
Биоинформатический анализ данных модельных организмов и методы сравнительной геномики являются эффективным средством обнаружения новых генов-кандидатов, регулирующих ответ клетки на повреждение ДНК, и предиктивных маркеров ответа на химиотерапию среди эволюционно консервативных генов.
-
Гены WDHD1, RAD54L, CSNK2B, UBE2V2, POLR2I, DSCC1, RAD50 и SMARCA5 регулируют чувствительность клеток рака яичника и опухолей головы и шеи к ДНК-повреждающим химиотерапевтическим препаратам: цисплатину, 5-фторурацилу и олапарибу.
-
Молекулярный механизм, лежащий в основе данного эффекта, связан с дефектом ответа клетки на повреждение ДНК при снижении экспрессии вышеуказанных генов, который заключается в снижении фосфорилирования киназы ATR и гистонового белка H2AX.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на международных научно-практических конференциях Американского общества клеточной биологии (American Society of Cell Biology, ASCB) (Филадельфия, США, 2014), Европейского онкологического общества (European Society for Medical Oncology, ESMO) (Дания, Копенгаген, 2016), на 20-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Россия, Пущино, 2016) и 7-ой международной научной конференции “Актуальные проблемы науки в XXI веке” (Россия, Москва,2016).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, среди которых 2 публикации в рецензируемых журналах, включенных в перечень ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций, и 4 тезиса докладов на международных конференциях.
Структура и объем диссертации. Данная диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста, включает 18 рисунков, 6 таблиц и 131 источник.
Биохимические и молекулярно-биологические механизмы развития устойчивости к цисплатину и пути ее преодоления
Механизмы резистентности к цисплатину разделяют на 2 группы:
1) снижение внутриклеточной концентрации цисплатина в клетке и усиление процессов детоксикации;
2) нарушение регуляции на уровне системы ответа клетки на повреждение ДНК.
Первая группа включает в себя ограничение внутриклеточного транспорта и эффлюкс лекарства, а также усиленную детоксикацию цисплатина, например, за счет активации синтеза глутатиона (Godwin et al. 1992, Siddik 2003, Chen et al. 2010, Galluzzi et al. 2012) (Таблица1).
Вторая группа механизмов включает усиление различных путей репарации ДНК, описанных ранее (NER, HR, TLS) и ингибирование сигнальных путей апоптоза (Galluzzi et al. 2012) (Таблица. 2).
Таким образом, широкий спектр механизмов, вызывающих устойчивость опухолевых клеток к цитотоксическому действию цисплатина связан с нарушениями в системе ответа клетки на повреждение ДНК. Молекулярные механизмы ответа клетки на повреждение ДНК, ассоциированные с действием цисплатина, не до конца изучены и могут служить источником решения проблемы резистентности в разработке инновационных противоопухолевых средств, схем лечения и прогнозирования течения заболевания.
Примером важности более глубокого понимания молекулярных сигналов ответа клетки на повреждение ДНК, в контексте действия цисплатина, является его более эффективный аналог-оксалиплатин, одобренный для лечения колоректального рака (Rothenberg 2000). Несмотря на то, что цисплатин и оксалиплатин вызывают одинаковые типы повреждения ДНК, их структуры несколько отличаются и по-разному распознаются белками репарации и белками, распознающими повреждение, такими как HMGB1, TBP и UBF. Отличия в процессах распознавания повреждений предположительно оказывают влияние на эффективность цитотоксического эффекта (Wang et al. 2005). Понимание механизмов, включающихся в ответ на повреждающее действие цисплатина, а также метаболизма цисплатина в клетке поможет в разработке новых, более совершенных аналогов этого соединения.
Кроме того, обнаружение новых мишеней, увеличивающих чувствительность опухолевых клеток к цисплатину, дает широкие перспективы в разработке эффективной комбинированной терапии, усиливающей действие цисплатина.
Идентификация генов-кандидатов в S. cerevisiae
Мы предположили, что идентификация генов низших эукариот, вовлеченных в ответ клетки на повреждение ДНК и регуляцию чувствительности к цисплатину поможет нам идентифицировать новые гены человека, регулирующие чувствительность к терапии цисплатином. Для проверки данной гипотезы из базы данных Saccharomyces Genome Database (SGD) (Cherry et al. 2012), которая является наиболее исчерпывающим источником информации о различных мутантных штаммах S.cerevisiae, была получена информация о генах, мутации в которых ассоциированы с чувствительностью к ионизирующему излучению (гамма- и рентгеновское излучение) и воздействию ультрафиолета (УФ) (uv/rad), и/или цисплатину (cisplatin) (832 и 126 генов соответственно) (Рисунок 3А, 3Б).
Полученная информация включала в себя данные двух различных типов исследований. 105 публикаций представляли собой узконаправленные исследования (low throughput screening (LTS)) и, как правило, детально характеризовали функцию не более 10 генов. Второй тип исследований представлял собой, так называемые высокопроизводительные скрининговые исследования (high throughput screening (HTS). В ходе исследований такого типа проводится оценка функции одновременно большого количества генов ( 15% генома). В качестве дополнительного источника информации о функции генов дрожжей были использованы данные 12 публикаций по данным высокопроизводительных исследований (HTS) (Bennett et al. 2001, Birrell et al. 2001, Begley et al. 2002, Birrell et al. 2002, Hanway et al. 2002, Game et al. 2003, Begley et al. 2004, Giaever et al. 2004, Wu et al. 2004, Lee et al. 2005, Liao et al. 2007, Xia et al. 2007). Полученная информация была объединена данными, полученными из базы данных дрожжей SGD (http://www.yeastgenome.org/), что позволило сформировать список генов для дальнейшего анализа.
Следует отметить, что генов дрожжей, аннотированных в качестве регуляторов чувствительности к цисплатину (группа – «сisplatin»), было значительно меньше по сравнению с генами, регулирующими чувствительность к УФ-облучению и радиации (группа «uv/rad») (Рисунок 3А). В связи с этим, в последующем анализе мы выделили их в отдельную группу (Рисунок 3Б). Всего лишь около четверти генов группы «uv/rad» из узконаправленных исследований (LTS) и высокопроизводительных скринингов (HTS) были аннотированы в двух и более исследованиях (29% и 21% генов всего списка соответственно) (Рисунок 3А).
Количество аннотированных генов в каждом высокопроизводительном исследовании достигало десятков и сотен кандидатов. Крупные скрининговые исследования c большим количеством тестируемых генов обладают высокой вероятностью ложноположительных результатов. Для оценки качества данных полученных при помощи высокопроизводительных скринингов, мы охарактеризовали биологическую функцию найденных генов при помощи базы данных Gene Ontology Consortium (GO) (Рисунок 3Б).
В результате было обнаружено, что в группе uv/rad узконаправленных исследований более всего генов, участвующих в репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и генов, функционально связанных с ответом клетки на повреждение ДНК. 164 гена из группы «uv/rad» высокопроизводительных исследований, аннотированные по крайней мере, в двух исследованиях (HTS2), были значимо обогащены сходными функциями с генами из узконаправленных исследований. Гены из высокопроизводительных исследований, аннотированные только в одном исследовании (HTS=1), напротив, не были обогащены биологическими функциями, ассоциированными с ответом клетки на повреждение ДНК.
Мы объединили гены группы uv/rad из скринингов LTS и HTS2 (всего 263 гена) со списком генов из группы cisplatin скринингов типа LTS и HTS (126 генов), которые также были значительно обогащены биологическими функциями, связанными с ответом клетки на повреждение ДНК. К полученному списку генов также были добавлены данные хемигеномных скрининговых исследований (CGS) (http://fitdb.stanford.edu; (Parsons et al. 2006, Cheung-Ong et al. 2012)), которые заключаются в обработке большого количества различных линий дрожжей с мутациями в различных генах лекарственными препаратами разных классов в широком спектре концентраций. Далее оценивалось влияние мутантных генов на чувствительность дрожжевых клеток к тому или иному препарату.
Нами были отобраны 214 генов, регулирующих чувствительность к цисплатину хотя бы в двух из трех CGS исследованиях (55 из которых были аннотированы во всех CGS трех исследованиях). Среди 214 генов 54 совпадали с генами из списка cisplatin генов из скринингов LTS и HTS.
Объединив найденные в базе данных CGS гены с uv/rad генами из LTS и HTS2 и списком cisplatin генов LTS и HTS, после окончательной сортировки и фильтрации повторов мы получили финальный список генов-кандидатов, состоящий из 286 генов.
Влияние снижения экспрессии обнаруженных генов-кандидатов на чувствительность к цисплатину и другим химиотерапевтическим препаратам в клетках опухоли головы и шеи и рака яичника
Терапия цисплатином и другими комплексными соединениями платины применяется в лечении плоскоклеточной карциномы головы и шеи, а также эпителиального рака яичника (Nwizu et al. 2014, Alkema et al. 2016). В качестве моделей опухоли для исследования роли обнаруженных нами генов в регуляции чувствительности к цисплатину, были использованы клеточная линия эпителиального рака яичника OVCAR-8, резистентная к цисплатину, а также 2 клеточные линии опухолей головы и шеи SCC61 и SCC25.
Для оценки роли обнаруженных нами генов в чувствительности к цисплатину, мы осуществляли снижение их экспрессии в клеточных линиях SCC61, SCC25 и OVCAR-8 в присутствии и в отсутствие цисплатина. На первом этапе эксперимента для нокдауна каждого гена в клеточной линии SCC61 были определены две лучшие миРНК (из 4х), использование которых давало бы наиболее стабильный нокдаун гена и изменение чувствительности к цисплатину по результатам трех повторов эксперимента. По результатам нокдауна 18 генов-кандидатов (данные не представлены) с помошью отобранных ми-РНК было отобрано 5 человеческих ортологов, представленных в кластерах, и один ген (UBE2V2), не представленный в кластерах.
Для нокдауна каждого из 6 генов в трех клеточных линиях была использована смесь из двух лучших миРНК. миРНК против гена REV3L,кодирующего каталитическую субъединицу ДНК полимеразы (Protein reversionless 3-like или (POLZ) - DNA polymerase zeta catalytic subunit), известной в качестве регулятора чувствительности к цисплатину согласно данным литературы и связанной с ответом клетки на повреждение ДНК, была взята в качестве положительного контроля сенситизации к цисплатину (Wittschieben et al. 2006, Shachar et al. 2009). Эффективность нокдауна генов смесью двух лучших миРНК оценивалась по анализу уровня экспрессии мРНК через 48 часов после трансфекции (Рисунок 10).
Метод количественной ПЦР был использован для анализа снижения экспрессии мРНК соответствующих целевых генов через 48 часов после трансфекции клеточной линии SCC61 миРНК. Данные об уровне экспрессии мРНК нормализованы на отрицательный контроль GL2.
Через 24 часа после трансфекции к клеткам добавляли цисплатин в концентрации IC20-IC30, определенной индивидуально для каждой клеточной линии или питательную среду в качестве отрицательного контроля. Через 72 часа оценивалась жизнеспособность. Было выявлено, что IC50 цисплатина для клеточной линии OVCAR8 составляет около 20uM и около 8uM для клеточных линий SCC25 и SCC61 (Рисунок 11).
Как правило, эволюционно консервативные гены выполняют фундаментально важные биологические функции в клетке. Нами был установлен эффект, который оказывает нокдаун каждого гена на жизнеспособность опухолевых клеток человека.
Нокдаун некоторых генов значительно снижал жизнеспособность опухолевых клеток. 72 часа после добавления отрицательного контроля (питательной среды). Нокдаун трех генов (POLR2I, RAD54L и WDHD1) на 30-60% снижал жизнеспособность клеток OVCAR-8, нокдаун генов POLR2I и WDHD1, и RAD54L значительно снижал жизнеспособность в клеточных линиях SCC61 и SCC25 соответственно. остальные гены (UBE2V2, DSCC1 и CSNK2B) оказывали незначительное влияние на выживаемость (Рисунок 12).
Параллельно было оценено влияние снижения экспрессии каждого гена на чувствительность клеток к цисплатину. После 72 часов обработки цисплатином нокдаун всех 6 генов увеличивал чувствительность к цисплатину в клеточных линиях OVCAR-8, SCC61 и SCC25 (Рисунок 13A).
Кроме того, было изучено, насколько специфичен к повреждающему ДНК действию цисплатина оказываемый эффект сенситизации, повторив эксперимент с участием других ДНК-повреждающих химиотерапевтических средств. Были использованы 5-фторурацил (5-ФУ), который приводит к угнетению репликации ДНК путем истощения запаса тимина в клетке и олапариб, который вызывает повреждение ДНК путем ингибирования поли-(АДФ-рибоза) - полимеразы (PARP1) (Longley et al. 2003, Davar et al. 2012), участвующей в репарации ДНК.
Паттерны сенситизации клеток к 5-фторурацилу и олапарибу, вызванной нокдауном исследуемых генов, были схожи с паттернами изменения чувствительности к цисплатину (Рисунок 13 Б, В). Нокдаун WDHD1 оказывал наиболее сильный эффект сенситизации клеток OVCAR-8 к данным препаратам.
Влияние снижения экспрессии генов-кандидатов на количества фокусов репарации повреждений ДНК, вызванных цисплатином
Участие обнаруженных нами генов в процессах репарации ДНК позволило нам выдвинуть гипотезу о возможном механизме их регуляции чувствительности к цисплатину. Известно, что повреждение ДНК, вызванное цисплатином, характеризуется формированием фокусов репарации, которые активируется в результате фосфорилирования гистонового белка H2AX (H2AX) (Paull et al. 2000, Jackson 2002) киназой ATR, с последующей активацией киназ CHK1 и CHK2 (Pabla et al. 2008). Белок H2AX фосфорилируется в гистонах, которые располагаются области повреждения ДНК, что является первым этапом в запуске сигнального каскада, для привлечения в место повреждения белков репарации и сборку их комплексов – фокусов репарации. Для понимания роли изучаемых нами генов в механизмах репарации ДНК мы исследовали, как влияет снижение экспрессии генов, регулирующих выживаемость опухолевых клеток и чувствительность к цисплатину, на формирование фокусов репарации, в состав которых входит H2AX. Через 24 часа после трансфекции опухолевых клеточных линий SCC61, SCC25 и OVCAR-8 миРНК против 6 генов-кандидатов и контрольных генов к клеткам добавляли цисплатин в концентрации 16 M, а 18 часов спустя оценивали количество фокусов репарации (Рисунок 14).
Трансфекция клеток миРНК против гена CHEK1 была использована в качестве положительного контроля. Белок Chk1, кодируемый данным геном, участвует в регуляции репликации ДНК и прохождении S-фазы клеточного цикла. В соответствии с ранее опубликованными данными, нокдаун этого гена сам по себе значительно повышает базовый уровень фокусов репарации ДНК, маркированных с помощью H2AX, что связано с нарушением репликации ДНК и блокировкой клеточного цикла (Turinetto et al. 2015).
Нокдаун генов-кандидатов напротив не оказывал влияния или приводил к уменьшению базового уровня фокусов H2AX в контрольных образцах без добавления цисплатина. В присутствии цисплатина для всех 6 генов наблюдалось значительное снижение количества фокусов репарации по крайней мере в 2 из 3 клеточных линий по сравнению с контролем GL2 (Рисунок 15). Наиболее сильное снижение количества фокусов репарации в присутствии цисплатина было вызвано нокдауном генов UBE2V2, POLR2I, WDHD1 и CSNK2B в резистентной к цисплатину клеточной линии рака яичника OVCAR-8 (Рисунок 15 В). Нокдаун этих генов практически отменял индукцию фокусов репарации цисплатином в OVCAR-8. Значительное снижение количества фокусов репарации ДНК может указывать на дефект ответа на повреждение ДНК, вызванный нокдауном выявленных нами генов-кандидатов и, таким образом, объяснить их увеличение чувствительности к цисплатину, вызванное снижением их экспрессии.