Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
1. НАДН цитохром в5 редуктаза/цитохром В5 9
1.1. НАДН цитохром Ь5 редуктаза 9
1.1.1. Биохимические, ре доке-свойства 11
1.2. Цитохром b5 11
1.3. Функции системы цитохром b5 редуктазы/цитохрома bs внешней мембраны митохондрий: установленные, предполагаемые, артефактные 13
1.3.1. НАДН семидегидроаскорбат редуктазная активность 15
1.3.2. НАДН аквакобаламин редуктазная активность
1.3.3. Предполагаемые антиоксидантные и прооксидантные функции системы цитохром Ъ5редуктазы/цитохрома bs внешней мембраны митохондрий 16
1.3.4. Участие CybsR-CybsOM системы в метаболизме стероидных гормонов и липидном обмене 17
1.4. Стресс-индуцированный «внешний путь окисления НАДН» и его возможные функции 18
1.4.1. Модели функционирования «внешнего пути» 19
1.4.2. Би-трансмембранная модель 20
1.4.3. Предполагаемые функции «внешнего пути» 21
2. Потенциал зависимый анионный канал (VDАС 1) 22
2.1. Структура VDAC 22
2.2. Регуляция метаболизма митохондрий 22
3. «Тканеспецифичная» ротенон-чувствительная надн убихинон (цитохром с) редуктаза 25
4. Апоптоз индуцирующий фактор (ALF) 28
4.1. Экспрессия ALF 29
4.2. Локализация ALF 29
4.3. Структура ALF 29
4.4. Редокс-свойства/биохимические свойства 31
4.5. Физиологическая роль ALF митохондриях 33
5. Методы регистрации активности надн-зависимых редуктаз ксенобиотиков внешних отделов митохондрий 34
6. Ксенобиотики, использованные в работе в качестве акцепторов 35
6.1. Менадион 35
6.2. Нитрофурантоин 36
6.3. Паракват 36
6.4. Доксорубицин 37
6.5. Даунорубицин 38
6.6. Арсеназо III 38
6.7. Люцигенин 38
Материалы и методы 40
1. Культуры клеток 40
1.1. Выделение нейтрофилов из крови крыс 40
1.2. Выделение крысиных перитонеальных макрофагов 40
1.3. Выделение кардиомиоцитов крысы 41
1.4. Оценка цитотоксичности 41
2. Получение гомогенатов и срезов ткани, выделение митохондрий 42
2.1. Приготовление гомогенатов печени и почек крысы 42
2.2. Выделение интактных митохондрий из печени крыс
2.2.1. Моделирование повреждения митохондриальных мембран 43
2.2.2. Оценка количества повреждённых митохондрий после выделения 43
2.2.3. Определение количества белка 44
2.3. Приготовление тонких срезов мозга крысы 44
3. Измерение продукции активных форм кислорода 44
4. Методы оценки основных параметров, характеризующих функциональное состояние изолированных митохондрий 45
4.1. Измерение объёма митохондриального матрикса 45
4.2. Установка для одновременной регистрации изменений концентрации различных ионов в среде инкубации и скорости потребления кислорода митохондриями
4.2.1. Измерение трансмембранного потенциала изолированных митохондрий 46
4.2.2. Измерение максимальной кальциевой емкости 46
4.2.3. Состояние системы окислительного фосфорилирования 47
4.3. Регистрация окисления пиридиннуклеотидов 48
5. Регистрация восстановления используемых акцепторов 48
5.1. Восстановление цитохромов с и bs 48
5.2. Восстановление ксенобиотиков 49
5.2.1. Протокол для измерения НАДН люцигенин-редуктазной активности в интактных и пермеабилизованных клетках 49
5.2.2. Анализ сайтов продукции ДБА в клетках НЕр-2 с помощью флуоресцентной микроскопии 50
5.2.3. Протокол для измерения НАДН люцигенин-редуктазной активности в гомогенатах тканей 50
6. Статистическая обработка 51
7. Материалы 51
Результаты и обсуждение 52
1. Разработка методов оценки активности надн-зависимых редуктаз ксенобиотиков внешних отделов митохондрий в митохондриальных и клеточных системах 52
1.1. Измерение активности НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий по окислению добавленного НАДН 52
1.2. Измерение активности НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий по восстановлению люцигенина до диметилбиакридена 1.2.1. Анализ продукции ДБА НАД(Ф)Н оксидоредуктазами в пермебилизованных клетках НЕр-2 с помощью проточной цитометрии 64
1.2.2. Анализ сайтов продукции ДБА в клетках НЕр-2 с помощью флуоресцентной микроскопии 67
1.2.3. Визуализация сайтов с высокой НАДН оксидоредуктазной активностью на срезах мозга 69
1.2.4. Анализ активности НАДФН оксидаз плазматической мембраны макрофагов и нейтрофилов и гомогената почек 69
1.3. Регистрация активности НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий по
генерации активных форм кислорода в присутствие автоокисляющихся акцепторов.73
2. Роль НАДН оксидоредуктазы внешних отделов митохондрий в генерации афк и индукции са-зависимой неспецифической поры (мРТР) 79
2.1. Продукция АФК суспензией митохондрий при добавлении внешнего НАДН 79
2.2. Открытие поры в присутствии ксенобиотиков и внешнего НАДН 82
3. Идентификация НАДН-зависимой оксидоредуктазы, ответственной за
активацию ксенобиотиков во внешних отделах митохондрий 83
3.1. Проверка гипотезы о существовании тканеспецифичной ротенон-чувствительной НАДН - оксидоредуктазы во внешних отделах митохондрий сердца 83
3.2. Эффект блокаторов VDAC и ингибиторов цитохром bs редуктазы 3 на проницаемость внутренней и внешней митохондриальных мембран для ионов, растворов и субстратов 84
3.3. Эффект блокаторов VDAC и ингибиторов цитохром bs редуктазы 3 на активность цитохром bs редуктазы 3 88
3.4. Эффект блокаторов VDAC и ингибиторов цитохром bs редуктазы 3 на активность внешней редуктазы ксенобиотиков 89
3.5.Эффект блокаторов VDAC на скорость окисления НАДН в присутствии рекос активных соединений 91
3.6. Эффект ионной силы среды на продукцию АФК внешними НАДН оксидоредуктазами в присутствии редокс-активных соединений 92
3.7. Эффект антител к VDAC и цитохром bs редуктазе на цитохром с - и люцигенин-редуктазную активность 93
3.8. Эффект нитрофурантоина, ингибиторов цитохром bs редуктазы 3 и блокаторов VDAC 1 на окислительно-восстановительное состояние эндогенных цитохромов bs и с 95
Заключение 99
Выводы 100
Список литературы
- Функции системы цитохром b5 редуктазы/цитохрома bs внешней мембраны митохондрий: установленные, предполагаемые, артефактные
- Регуляция метаболизма митохондрий
- Редокс-свойства/биохимические свойства
- Выделение крысиных перитонеальных макрофагов
Функции системы цитохром b5 редуктазы/цитохрома bs внешней мембраны митохондрий: установленные, предполагаемые, артефактные
Удельная активность CyfoR в ОММ выше, чем в микросомах [123]. Митохондриальный цитохром bs высоко экспрессируется, но в различных количествах во всех тестируемых тканях [29]. Высокая активность системы CyfoR-CyfoOM (измеряемая как НАДН цитохром с редуктазная активность) может свидетельствовать о важной роли именно митохондриальной системы в клеточной физиологии.
При мутациях в гене, кодирующем цитохром bs редуктазу развивается энзимопеническая метгемоглобинемия (нарушение восстановления метгемоглобина, резкое увеличение количество метгемоглобина) двух типов. При нарушении синтеза только растворимой изоформы развивается I тип заболевания, при нарушении синтеза обоих изоформ II тип. При наследовании двух аллелей кодирующих цитохром bs редуктазу с мутациями в ФАД- или НАДН-связывающих доменах, снижающих активность или/и стабильностиь фермента у человека и животных развивается наследственная метгемоглобинемия [138]. При первом типе заболевания стимулируются минорные пути прямого восстановления метгемоглобина эндогенными восстановителями (аскорбиновой кислотой, восстановленным глютатионом, флавином, тетрагидроптерином, цистеином, метаболитами триптофана) или другими системами [139]. Данное заболевание характеризуется цианозом, отдышкой, тахикардией, быстрой утомляемость, может наблюдаться низкое интелектуальное развитие [140]. Поскольку мембранно-связаная форма CyfoR локализована во многих внутриклеточных органеллах (ЭПР, Гольджи, митохондрии, плазматическая мембрана), где, по-видимому, имеет специфические функции, неясно, какую роль играет именно цитохром bs редуктаза внешней мембраны митохондрий в общем проявлении дефицита цитохром Ъ5 редуктазы.
Микросомальный цитохром bs вовлечен в ряд клеточных процессов, таких как десатурация жирных кислот, биосинтез стероидных гормонов, восстановление метгемоглобина и метаболизм лекарственных препаратов. У мышей нокаутированных по цитохрому Ъ5 микросомальному изменяется оборот стероидных гормонов и лекарственных препаратов [100]. Также проявляется метгемоглобинией, дефектами кожи и отставанием в неонатальном развитии [99]. Отсутствие цитохрома bs вызывает активацию цитохром Р450 в неонатальном периоде, что частично компенсирует недостаток цитохрома bs [99, 100].
Пока нет опубликованных данных об удалении только митохондриального цитохрома bs. Эксперименты с использованием siRNA, значительно понижающие продукцию митохондриального цитохрома bs показывают, что данная изоформа помимо участия в метаболизме лекарственных препаратов, вовлечена также в синтез липидов при дифференцировке адипацитов в качестве редокс-партнера MOSC2 [43].
Данные полученные с использованием моделей удаления или подавления одной из изоформ цитохрома bs, по-видимому, следует интерпретировать с осторожностью, поскольку высока вероятность того, что увеличение активности другой изоформы или изоформ цитохрома Р450 будет функционально компенсировать дефицит другой.
Одной из первых сообщенных физиологических функций митохондриальной системы цитохром bs редуктаза/цитохром bs было восстановление семидегидроаскорбата до аскорбата [101]. Эта реакция протекает во внешней мембране митохондрий многих органов и тканей, включая печень, почки, надпочечники, сердце, мозг, легкие и селезенку [102]. Сообщалось, что помимо основной активности во внешней мембране митохондрий, небольшая активность наблюдалась во фракции микросом и аппарата Гольджи. Однако, не совсем ясно, действительно ли реакция протекает в этих органеллах, или является результатом контаминации поврежденными митохондриями [102]. В пользу этого предположения говорит тот факт, что только митохондриальный цитохром bs обладает достаточной движущей силой для восстановления семидегидроаскорбата (из-за низкого восстановительного потенциала) в отличии от микросомального [103]. Более того, локализация редуктазы семидегидроаскорбата и ротенон-нечувствительной цитохром с редуктазной активности совпадала не полностью [102]. С учетом того, что хелатор переходных металлов (хрома, молибдена и вольфрама) теноилтрифторацетон [104] эффективно ингибирует НАДН-семидегидроаскорбат редуктазную активность в концентрациях, в которых не влияет на НАДН - цитохром с редуктазную активность [101, 102] можно предположить, что для протекания реакции необходим еще какой-либо кофактор, например, Мо-содержащй. В митохондриях дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) цитохром bs редуктаза участвует в восстановлении D-эритроаскорбильного свободного радикала и, по-видимому, является важным элементом антиоксидантной защиты [105].
Было показано, что система цитохром bs редуктаза/ цитохром bs внешней мембраны митохондрий катализирует восстановление аквакобаламина до кобаламина (ЕС 1.6.99.8), важная реакция в синтезе коферментов кобаломина, 5 -деоксиаденозилкобаламина и метилкобаломина [114, 115]. Митохондриальная система ответственна за -40% НАДН-зависимого восстановления аквакобаламина(Ш) в клетках печени крыс и не нуждается в других кофакторах для данной активности. Остальные 60% обеспечивает микросомальная система цитохром bs редуктаза/цитохром bs [114, 115]. Данная система специфична для аквакобаламина и не восстанавливает цианокобаламин. В стандартных условиях (25С, рН 7.1) скорость восстановления аквакобаламина очищенными цитохром bs редуктазой и цитохромом bs внешней мембраны митохондрий составляла около 5% от скорости НАДН - цитохром с редуктазной реакции и 2% от феррицианид редуктазной активности. Во фракции внешней мембраны митохондрий (ОММ) в квазифизиологических «оптимальных» экспериментальных условиях при (40С, рН 7.1) специфическая активность составляла -110 нмол/мин/мг белка. Km для НАДН и аквакобаломина были определены как 14,4 цМ и 41,9 цМ, соответственно [114, 115].
Физиологическое значение митохондриальной системы восстановления аквакобаломина не вполне ясно. Известно, что в клетках присутствует несколько систем, способных восстанавливать аквакобаломин до кобаломина. Растворимая редуктаза мономерной метионинсинтетазы (РМС), 78кДа вспомогательный фермент метионин-синтетазы, специфический медиатор восстановления кобаломина II и метионин-синтетазной реакции [98]. Цитохром Р450 редуктаза и новыя редуктаза - NR1 способны восстанавливать кобаломин II и активировать метионин-синтетазу, в присутствии растворимого цитохрома bs [96-98]. Можно предположить, что данная реакция будет проходить в присутствии цитохрома bs, связанного как с митохондриальной, так и микросомальной мембраной.
Регуляция метаболизма митохондрий
Вопрос о физиологической роли оксидоредуктазной активности AIF очень интересен. Действительно, неясно какой смысл имеет сохранение оксидоредуктазных свойств в ходе эволюции (AIF - эволюционно консервативная НАДН оксидоредуктаза), в то время как, ее активность стремится к нулю. Однако, ответ на этот вопрос требует дополнительных исследований активности мембраносвязанного AIF в IMS интактных, активно дышащих и генерирующих трансмембранный потенциал, митохондриях. Во-первых, необходимо идентифицировать природные акцепторы AIF. Во-вторых, выяснить эффект высокого трансмембранного потенциала на оксидоредуктазную активность AIF. Вполне возможно, что эта активность намного выше, чем принято считать.
Ряд данных свидетельствует о том, что оксидоредуктазная активность AIF действительно имеет важное физиологическое значение. Данные о возможной физиологической роли AIF в митохондриях были получены с использованием AIF-дефицитных моделей: AIF /у эмбриональных стволовых клеток, человеческих клеток HeLa в которых экспрессия AIF была подавлена siRNA [125], мышей линии Harlequin, у которых встраивание ретровируса в первый интрон гена AIF приводило к гипоморфному снижению уровня белка до 10-20% от нормального значения [125-128], а также у мышей, в которых AIF был специфически инактивирован в сердечных и скелетных мышцах [129, 130].
Было показано, что снижение экспрессии AIF приводило к разнообразным порокам развития лабораторных животных, поражению ЦНС, ретины, сердца и мышц, снижению устойчивости митохондрий и клеток к различным воздействиям [126, 127]. На различных животных и клеточных моделях было показано, что подавление AIF вызывало лактатный ацидоз, 50-60% снижение скорости V3 (АДФ) дыхания на малате с пируватом, -50% снижение общей клеточной НАДН феррицианид-редуктазной активности, активацию гликолиза и повышение зависимости клеток от него [125, 129, 130].
Известна единственная митохондриальная патология, связанная с AIF у людей. При делеции нуклеотидов 1601-1603 в 5 экзоне гена AIF происходит делеция Arg201 в белковой молекуле [131]. Мутация вызывала раннюю прогрессирующую митохондриальную энцефаломиопатию, характеризующуюся аксональной сенсорной и моторной переферической нейропатией, выраженной мышечной атрофией, сниженной дыхательной активностью, тканеспецифичным истощением митохондриальной ДНК, повышенным уровнем лактата в плазме, ассоциированными со снижением активности комплексов I, III, и IV [131]. При этом апоптогенные свойства AIFAR201 и ДНК-связывающие свойства рекомбинантного белка возрастали. Согласно данным компьютерного моделирования, AR201 мутация может дезорганизовать Р-клубок 191-203 а.к., который защищает микроокружение активного центра и важен для правильного сворачивания белка и связывания ФАД (а возможно, и для взаимодействия с редокс-партн ерами) [54]. Действительно, редокс-свойства рекомбинантного AIFAR201 существенно отличаются от свойств нативного фермента. Мутантный белок слабее связывает ФАД и формирует более короткоживущие комплексы переноса заряда. При этом скорость окисления НАДН повышается на два порядка. Следовательно, редокс-свойства AIF важны для его физиологической функции - биогенеза комплексов дыхательной цепи.
Для измерения НАДН оксидоредуктазной активности существует три принципиальных возможности: 1) регистрация окисления доноров электронов (НАД(Ф)Н), 2) регистрация восстановления акцепторов и 3) регистрация образования АФК, если акцептор способен автоокисляться. Каждый подход имеет свои особенности и ограничения. Поэтому мы рассмотрели применимость данных подходов для изучения активности редуктаз ксенобиотиков внешних отделов митохондрий, описанных в литературе.
Часто оценку активности НАДН оксидоредуктаз проводят по окислению НАДН флуориметрическим или спектрофотометрическим методами. НАДН поглощает ультрафиолетовое излучение с пиком поглощения соответствующем длине волны 339 нм, коэффициент экстинкции равен 6200 М_1см_1[260]. У окисленной формы, НАД, пик поглощения наблюдается при 229 нм. Таким образом окисление НАДН можно регистрировать спектрофотометрически при 339 нм, по уменьшению абсорбции. Также НАД+ и НАДН флуоресцируют по-разному. В растворе НАДН имеет пик эмиссии при 460 нм (длина волны возбуждения 339 нм) и продолжительность высвечивания 0,4 нсек, в то время как окисленная форма кофермента не флуоресцирует [261].
Вторым основным подходом измерения активности НАДН оксидоредуктаз является регистрация восстановления акцепторов исследуемых ферментов. Среди используемых искусственных и естественных акцепторов известны: феррицианид, гексааминорутений (III), гомологи и аналоги природного убихинона (Q0, Qi, Q2, дурохинон, пентил-убихинон, децил-убихинон), цитохром с, кислород, тетразолиевые красители. Каждый из перечисленных акцепторов имеет свойства, ограничивающие его применение, так, например, восстановление феррицианида ингибируется избытком субстрата (при восстановлении комплексом I дыхательной цепи), длина волны поглощения восстановленной формы цитохрома с совпадает с длиной волны, отражающей набухание митохондрий.
Для измерения НАДН оксидоредуктазной активности внешних отделов митохондрий необходимо подобрать акцептор, который не будет восстанавливаться другими митохондриальными дегидрогеназами и метод регистрации восстановленной формы должен не пересекаться с другими изменяющимися характеристиками. В настоящее время в литературе не описано акцептора для измерения активности систем во внешних отделах митохондрий, который бы отвечал необходимым требованиям.
Третьим подходом измерения активности НАДН оксидоредуктаз, является регистрация образования АФК. Активные НАДН оксидоредуктазы могут напрямую восстанавливать кислород и в условиях использования автоокисляющегося акцептора АФК можно регистрировать, как побочные продукты. В настоящее время существует много способов регистрации как супероксид-аниона, так и гидропероксида. Но, как и в случае подбора акцептора, необходимо наличие характеристики, позволяющей вычленять вклад НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий в детектируемое накопление АФК в субклеточных и клеточных моделях.
Таким образом, в настоящее время, существует несколько методов регистрации активности НАДН оксидоредуктаз, но ни один из них не адаптирован для исследования ферментных систем внешних отделов митохондрий. Для изучения и идентификации редуктаз ксенобиотиков необходимо разработать или усовершенствовать уже имеющиеся подходы регистрации активности похожих ферментов.
Полициклический ароматический кетон, основой которого является 1,4-нафтохинон. Менадиона натрия бисульфит применяется в качестве лекарственного препарата как синтетический водорастворимый аналог витамина К (торговое наименование этой соли — викасол). Иногда менадион называют витамином Кз, хотя производные нафтохинона без боковой цепи в 3-м положении не могут проявлять все функции витаминов группы К. Менадион является предшественником витамина Кг, поэтому корректнее называть его провитамином. Препарат «Викасол» был разработан в СССР в качестве водорастворимого аналога витамина К, что позволяет применять его парентеральным путем. Также проводились экспериментальные исследования менадиона в качестве химиотерапевтического средства для лечения злокачественных новообразований.
Менадион относится к хинонам, легко проникает через клеточную мембрану. Широко известен своей способность вызывать в клетке окислительный стресс, за счет редокс-циклических реакций превращения хинона в семихинон, что ведет к образованию активных производных кислорода, таких как супероксид-анион радикал, пероксид водорода и гидроксильный радикал [132, 133]. Показано, что менадион способен восстанавливаться во внешних отделах митохондрий, тем самым вызывать окислительный стресс и пермебилизацию митохондриальных мембран [83, 267].
Редокс-свойства/биохимические свойства
Восстановление отслеживали по изменению светопоглощения - альфа-полоса поглощения восстановленного цитохрома с имеет максимум при 550 нм и минимум при 540 нм. Коэффициент экстинкции восстановленной формы цитохрома с (А550-540 нм) составляет 18,2 мМ_1см_1. Этот подход применяли как к экзогенному (добавленному), так и к эндогенному цитохрому с. Восстановление цитохрома bs оценивали по соотношению светопоглощения при длинах волн 559 и 575 нм, принимая коэффициент экстинкции равным 15,6 мМ см"1.
Для исследования состояния эндогенных цитохромов в митохондриальной суспензии был разработан следующий протокол: митохондриальная суспензия (4 мг белка/мл) помещалась в экспериментальную кювету и в кювету сравнения в стандартной KCl-среде инкубации дополненной 1мМ ЕГТА, 1 мМ NaCN, 1 мкМ ротеноном, 1 мкМ антимицином А и 1 мкМ миксотиазолом. Где указано (см. соответствующие главы «Результатов и обсуждений»), в экспериментальной кювете также были другие добавки. В течении эксперимента снимался спектр поглощения (340-600 нм) в течении 30 минут с помощью спектрофотометра Сагу 100 Scan (Varian, Австралия). В ходе эксперимента добавляли 20 цМ НАДН и 25 цМ нитрофурантоина. Изменения в состоянии цитохромов bs и с регистрировались А559-А575 и А550-А540, соответственно.
Для исследования активности НАДН оксидоредуктазы внешней мембраны митохондрий мы оценивали ее способность восстанавливать внешний (добавленный) цитохром с. По протоколу: в стандартной KCl-среде, содержащей 1 мМ ЕГТА, 100 цМ НАДН, 1 цМ антимицин А, 1 цМ миксотиазол и различные ингибиторы (или другие исследуемые соединения) инкубировали митохондрии (0,02 мг. белка/мл) в течении 10 минут. Далее к суспензии добавляли цитохром с с финальной концентрацией 50 цМ, и записывали изменение абсорбции при длине волны 550 нм с помощью планшетного спектрофлюориметра. Коэффициент экстинкции для цитохрома с 18,2 мМ_1см_1.
Восстановление акцепторов НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий служит показателем активности данных систем. В нашей работе, кроме природных акцепторов (цитохромов) мы также использовали различные ксенобиотики.
Восстановление люцигенина регистрировали по уменьшению абсорбции при 368 нм. Измерения проводились в 2 мл термостатируемых кюветах, используя спектрофотометр Uvikon 923 (Kontron Instruments, США). Люцигенин при двухэлектронном восстановлении образует водонерастворимый флуоресцирующий агент диметилбиакриден (ДБА). Чаще в нашей работе восстановление люцигенина оценивали по накоплению ДБА.
Работа с клетками проводилась по следующей схеме: клетки снимали трипсином-ЭДТА. Трипсин нейтрализовался средой инкубации (DMEM или RPMI 1640) содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Далее исследования проводили на интактных клетках и пермебилизованных. Протокол для интактных клеток: клетки отмывали инкубационной средой, мягко осаждались при 600-1000 g 5 минут и подсчитывали. Жизнеспособность клеток (процент мертвых клеток) определяли окраской трипановым синим. Клетки по 20000-200000 ресуспендировали в 1-2 мл инкубационной среды и распределяли в пять экспериментальных пробирок. 1-без добавок; 2 - 200 цМ люцигенин; 3 - люцигенин и антимицин А (1 мкг/мл); 4 и 5 - люцигенин, антимицин А и 1 мМ NaCN. Пробирки 1-4 инкубировали час и пробирка №5 два часа с постоянным мягким покачиванием. Затем клетки дважды промывали инкубационной средой без сыворотки и антибиотиков. Регистрацию накопления ДБА проводили с помощью проточного цитометра PAS III (Partec, Германия), экстинкция 488нм (аргоновый лазер) и эмиссия 520-560 нм. Средний размер клеток контролировали с помощью FSC фильтра. Обычно, накопление ДБА проверяли в 20000-50000 клетках из каждого образца. Для пермебилизованных клеток протокол был следующим, снятые клетки промывали КС1-средой (125 мМ КС1, 20 мМ маннитол, 10 мМ HEPES, 2 мМ КН2Р04, и 1 мМ ЕГТА) и осаждали при 600-1000 g 5 минут. Клетки ресуспендировали и помещали в пробирки. Для пермебилизации клеточной мембраны использовали 0,0005-0,004% (финальная концентрация в суспензии клеток) дигитонина. Минимальную, но эффективную концентрацию подбирали для каждой клеточной линии отдельно. Постановка эксперимента: первая пробирка - контрольная, без добавок; вторая - 100 цМ люцигенин; третья - люцигенин и антимицин А (0,5 мг/мл); четвертая - люцигенин, антимицин и 1 мМ NaCN; пятая - люцигенин, антимицин А и 250 цМ НАДН; шестая, люцигенин, антимицин А и 250 цМ НАДФН; седьмая и восьмая, люцигенин, антимицин А, НАДН и 1мМ NaCN; девятая и десятая, люцигенин, антимицин А, НАДФН и NaCN. Пробы 1-7 и 9 инкубировали 20 минут, и 40 минут инкубировали пробы 8 и 10, с постоянным мягким покачиванием. Длительное инкубирование проводилось для контроля постановки опыта. После инкубации клетки дважды отмывали KCl-средой. Далее измеряли интенсивность флюоресценции ДВА на проточном цитометре.
Клетки НЕр-2 культивировали в среде Игла модифицированной Дюльбеко, с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки, пинициллина (100 ед/мл), стрептомицина (0,1 мг/мл), 20 мМ Hepes (рН 7,4) и 20 мМ MgCh при 37С в насыщенной водой атмосфере с содержание 5% СОг. Клетки были посажены на культуральный пластик (BioCioat Variety Pack, Erembodegem, Belgium) и инкубировали в течение двух дней перед обработкой. Затем добавляли 5 цМ MTR, и инкубировали в тех же условия 45 минут в темноте. Затем клетки отмывали в KCl-среде и пермебилизовали дигитонином (0,001%) в таком же буфере, который содержал, где указано, в указанных концентрациях ингибиторы НАД(Ф)Н оксидоредуктаз, антимицин А (1 мкг/мл) и 500 нМ FCCP. Затем 100 цМ люцигенина и, где указано, НАДН или НАДФН были добавлены в исследуемую суспензию. После 30 минутной инкубации в темноте, чашки были дважды промыты и рассмотрены с помощью a Leica TCS SP5 конфокального микроскопа (Leica, Германия) используя следующие лазеры для возбуждения и фильтры для эмиссии: 543 и 560-664 (для MTR), 405 и 415-480 (для люцигенина). Среднюю флуоресценцию случайных клеток подсчитывали используя приложение Leica Suite Advanced Fluorescence 2.1.0 программного обеспечения.
Гомогенат печени крыс помещали в стандартную среду инкубации, дополненную субстратами дыхания, люцигенином, антимицином A, FCCP, концентрация белка 1 мг/мл. Аликвоты из данной смеси были добавлены в пробирки с ингибиторами НАД(Ф)Н оксидоредуктаз и инкубировали 5 минут, перед этим раскапывались в лунки 96-луночного планшета (Greiner Bio-One, GmbH, Germany) (100 цл/лунка), где предварительно было добавлено определенное количество НАДН или НАДФН. Затем записывали кинетику образования ДБА с помощью планшетного спектрофлуориметра Infinite F200 (Тесап, Австрия) (максимумы возбуждения и эмиссии были 485 и 525 нм). Гомогенат почек крысы (0,5 мг/мл) инкубировали перед измерением в стандартной среде с 3 мМ ЕГТА и различными концентрациями VAS2870 и плюмбагина в течение часа при 37С. Антимицин A, FCCP и, в некоторых случаях, 100 цМ SDS были добавлены за 5 минут до окончания инкубации.
Спектр флюоресценции (возбуждение 300-510 нм, эмиссия при 520 нм; возбуждение при 430 нм, эмиссия при 440-650 нм; возбуждение при 488 нм, эмиссия при 500-650 нм; шаг 0,5 нм) люцигенина и ДБА в гомогенате записывался в 2 мл пластиковых кюветах используя Сагу Eclipse спектрофлуориметр (Varian Australia Piy LTD, Австралия). Ширина щелей была 2,5 и 5 нм для возбуждения и эмиссии, соответственно. Интенсивность флюоресценции (0-1000) выражалась в условных единицах прибора (AU).
Выделение крысиных перитонеальных макрофагов
Далее мы рассмотрели VDAC 1 и цитохром bs редуктазу как возможных претендентов на роль НАДН оксидоредуктазы внешних отделов митохондрий ответственной за активацию ксенобиотиков. VDAC1 состоит из 32 кДа полипептидной цепи, которая образует Р-складки в мембране. Согласно двум конкурирующим моделям, стенка канала образованна 19 Р-слоями или 13 Р-слоями и одной N-концевой а-спиралью из 20 аминокислот [60]. Внутренний диаметр канала около 2,5 нм, он достаточно большой для прохождения неполярных 4 кДа соединений или полярных катионных или анионных молекул меньшего размера. НАДН-связывающий сайт (Kd = 87 цМ) расположен в просвете канала [60], и способен ограничивать проницаемость канала [66]. VDAC обладает небольшой анионной специфичностью [60], поэтому мы предположили, что среда с высокой ионной силой (150мМ) снизит анионную избирательность по сравнению со средой с низкой ионной силой и, следовательно, будет увеличен доступ катионных акцепторов к активным центрам VDAC1, если VDAC1 является внешней НАДН оксидоредуктазной системой.
С другой стороны, ионные взаимодействия важны для нормального функционирования цитохром bs редуктазы 3: связывания НАДН и транспортировки гидрид-иона к ФАД для формирования полностью восстановленного флавина (ФАДН-) [10, 15]. Можно предположить, что катионные акцепторы будут лучше взаимодействовать с восстановленным ФАДН- в среде с низкой ионной силой. Также, заряженные аминокислотные остатки такие, как Apr 63 и Лиз 83 определяют силу связывания НАДН и НАД+, что может замедлить диссоциацию НАД+ при низкой ионной силе [10, 15]. Рис. 35 показывает, что увеличение ионной силы от 0 до 50 мМ вызывает уменьшение продукции супероксид-аниона со всеми акцепторами. Дальнейшее увеличение ионной силы стимулировало продукцию супероксид-аниона в присутствие анионного акцептора нитрофурантоина, уменьшало в присутствие катионных акцепторов люцигенина и параквата, и оказывало незначительный эффект на менадион-зависимую генерацию супероксид-аниона. Среда содержала ингибитор дыхательной цепи антимицин А и разобщитель FCCP, что минимизирует эффект митохондриального потенциала на локальную концентрацию редокс-активных соединений.
Эффект ионной силы среды измерения на уровень супероксид-аниона, генерируемого НАДН оксидоредуктазами внешних отделов митохондрий в присутствии катионных, анионных и нейтральных акцепторов. Митохондрии (0,3 мг белка/мл) помещали в среды с различной ионной силой, содержавшие 5 мМ малат, 5 мМ пируват и, где указано, 5 цМ менадион, 25 цМ люцигенин, 25 цМ нитрофурантоин, 250 iM паракват. Индуцированная НАДН (100 цМ НАДН) СОД-чувствительная (130 ед/мл СОД) люминесценция MCLA интегрировалась в течении 15 минут. Представлены относительные изменения, 100% люминесценции соответствуют: 1,36-106 ± 1,85 105 (люцигенин), 3,84-105 ± 5,55-104 (паракват), 1,44106 ± 1,71 105 (менадион), 1,14-105 ± 1,73 104 (нитрофурантоин) условных единиц. Точки на кривых - среднее значение ± стандартная ошибка трех независимых экспериментов (п=9).
Таким образом, полученные данные говорят против VDAC 1 и за цитохром bs редуктазу 3, как за систему, отвечающую за активацию ксенобиотиков. Эффект антител к VDAC и цитохром bs редуктазе на цитохром с -и люцигенин-редуктазную активность Мы исследовали влияние антител к VDAC (изоформам 1-3) и к цитохром bs редуктазе на люцигенин - зависимое окисление НАДН и продукцию супероксид-аниона, а также на НАДН-зависимое восстановление добавленного цитохрома с в суспензии интактных митохондрий.
Антитела к VDAC имели специфичность к анимикислотной последовательности 185-197, общей для всех изоформ. Антитела к цитохром bs редуктазе 3 были двух типов, первые к эпитопу 1-60 аминокислотные остатки (Н-60), вторые к аминокислотной последовательности из 10-20 остатков, расположенных между 150 и 200 (D-15) (Рис. 35). Anti-VDAC Ab Anti-Cyb5R3 Ab Anti-Cyb5R3 Ab
Рис. 36 показывает, что только антитела к цитохром bs редуктазе 3 к N-концевому эпитопу существенно подавляли все измеряемые НАДН-зависимые активности. Относительная низкая эффективность антител к внутреннему эпитопу Су bsB3, предположительно, может объясняться низкой доступностью данного участка (расположен в щели между двумя доменами, заполненной кофакторами, донорами и акцепторами (природными или искусственными)). тш АЬУОАС
Эффект специфических антител к VDAC (изоформам 1-3) и к цитохром bs редуктазе 3 на НАДН оксидоредуктазную активность внешних отделов митохондрий в митохондриях. 100% скорость соответствует: 2,35 ± 0,63 нмол НАДН мин" мг белка"1; 261 916 ± 26 550 условных единиц люминесценции MCLA; 170 ± 15.5 нмол цит смин -мг белка"1. В колонках среднее значение ± стандартная ошибка трех экспериментов (п=9).
В литературе описано несколько попыток использовать специфичные антитела к VDAC и Су ЯЗ для выяснения природы системы, участвующей в активации редокс соединений во внешней митохондриальной мембране и в плазматической мембране, полученные результаты противоречивы. В нашей работе только антитела к N-концевому эпитопу существенно подавляли измеряемые показатели. Поэтому, выбор антител к CybsB3 для подавления ее биохимической активности, и интерпретация полученных данных должны делаться с осторожностью.
Эффект нитрофурантоина, ингибиторов цитохром bs редуктазы 3 и блокаторов VDAC 1 на окислительно-восстановительное состояние эндогенных цитохромов bsuc Для идентификации фермента, отвечающего за активацию ксенобиотиков во внешних отделах митохондрий, а также для исследования механизма окисления цитозольного НАДН и восстановления редокс-активных соединений во внешних отделах митохондрий, мы изучили окислительно-восстановительное состояние эндогенных цитохоромов с и Ъ5. Для решения данной задачи мы использовали нитрофурантоин, так как он не образует нерастворимые продукты, в отличии от люцигенина [231, 245]. Как следует из Рис. 37, добавление 20 цМ НАДН вызывало восстановление эндогенного цитохрома bs (панель А). Самопроизвольное окисление эндогенных цитохромов интактных митохондрий не наблюдалось более 30 минут. Добавление нитрофурантоина вызывало быстрое, но кратковременное восстановление цитохрома с. Эндогенные цитохром с и bs окислялись сразу после окисления НАДН (не показано). Восстановление цитохрома с в основном СОД нечувствительно. Таким образом, радикалы нитрофурантоина способны напрямую транспортировать электроны с цитохрома bs или его редуктазы на цитохром с в межмембранном пространстве или на кислород.
Ингибиторы цитохром bs редуктазы 3 оказывают различное влияние на редок состояние эндогенного цитохрома bs (панель Б): PTU уменьшает степень восстановления, мерсалиловая кислота ускоряет и остальные ингибиторы замедляют окисление цитохрома Ь5. Неспецифические ингибиторы цитохром bs редуктазы 3 DIDS и декстран (панель В) также замедляли окисление цитохрома bs.
G3139 и эрастин (панель В) не действуют на нитрофурантоин - зависимое окисление цитохрома bs внешней мембраны, в то время как состояние и динамика восстановления цитохрома с были значительно изменены. DIDS и G3139, и гораздо в меньшей степени эрастин и декстран уменьшали степень восстановлености цитохрома с. Эти данные показывают, что нитрофурантоин (и, предположительно, другие редокс-активные соединения) получают электроны от пары цитохром bs редуктаза - цитохром bs, а не от цитохрома bs, непосредственно. Блокирование VDAC1 предотвращает транспорт радикалов редокс-активных соединений в межмембранное пространство митохондрий, но имеет незначительный эффект на окисление-восстановление ксенобиотиков. Объединив данные, ясно видно, что VDAC1 не принимает участие в активации редокс-активных ксенобиотиков.