Введение к работе
Актуальность темы: В последние годы интерес к ферментам, выделяемым из животного сырья, возрастает, особенно в связи с их применением в медицине при лечении различных заболеваний. Однако проблема повышения качества инъекционных ферментных препаратов требует новых подходов к методам их выделения, очистки и анализа. Наибольший интерес для промышленного получения высокочистых биопрепаратов представляют технически простые, масштабируемые методы, основанные на использовании сорбционно-хроматографических процессов, которые позволяют улучшить качество получаемого препарата за счет избирательной сорбции целевого компонента и обратимой десорбции с него. С другой стороны применение хроматографии в промышленности создает чрезвычайно широкие перспективы для более рациональной организации технологических процессов выделения и очистки биологически активных веществ. Хроматографические методы еще недостаточно используются в медицинской промышлегшости, и только в последнее время была показана перспективность и целесообразность использования макропористых носителей для выделения и получения высокочистых ферментных препаратов (Рудометова, 1994).
Объектом данного исследования был выбран фермент гизлуронвдаза (КФ 3.2.1.35), являющийся основным компонентом препарата "Лвдаза" и выделяемый из семенников крупного рогатого скота. Фермент уменьшает вязкость межклеточного вещества, способствует увеличению проницаемости тканей и облегчает движение жидкостей в межтканевых пространствах. Препарат "Лидаза" применяется в медіодіше для ускорения всасывания лекарственных веществ, рассасывания рубцов, вводится подкожно, внутримышечно или путем ингаляций. До настоящего времени препарат
получали по технологии, основанной на фракционировании фермента от балластных примесей из осветленного экстракта семенников крупного рогатого скота органическим растворителем - ацетоном. Данная технология имеет ряд существенных недостатков: шрывоопасность производства, токсичность производства, большие энергозатраты на регенерацию органического растворителя. Получаемый ферментный препарат обладает низкой удельной активностью.
В связи с вышеизложенным разработка сорбционно-хроматографического процесса выделения и очистки фермента гиалуронидазы представляется перспективной и актуальной. С другой стороны, до сих пор ни один из ферментов, катализирующих синтез или гидролиз гиалуроновых кислот не был изучен в деталях (Kreil, 1995), поэтому изучение физико-химических свойств высокоочищеиного фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота является также актуальным.
Задачи исследования. Целью работы являлось хроматографическое выделение и изучение свойств высокоочищенной гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота в разработка сорбционного метода получения препарата "Лидаза".
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследование физико-химических и биохимических свойств фермента
гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота,
-
Изучение закономерностей сорбции гиалуронидазы на ионитах различной природы в статических условиях.
-
Выбор оптимального сорбента для выделения фермента.
-
Разработка на основе полученных данных процесса сорбциоино-хроматографического выделения фермента;
5. Оптимизация и масштабирование сорбционного процесса выделения с целью использования технологии в промышленном масштабе.
Научная новизна. Впервые выделен протомер гиалуронидазы га семенников крупного рогатого скота и изучены его биохимические свойства, получены данные о наличии дисульфидных связей между протомерами.
Впервые изучены равновесные и термодинамические параметры сорбция полимерных форм гиалуронидазы в статических условиях на различных ионогенных и неионогенных сорбентах. Установлена взаимосвязь структуры матрицы молекулярного сорбента на основе стирола (Полисорб) с модифицированной поверхностью и макропористого ионогенного сорбента (КУ-23), имеющего в основе ту же матрицу, с избирательностью сорбции гиалуронидазы, определяемой ион-ионным и молекулярным взаимодействиями.
Сформулированы факторы^ определяющие взаимодействие фермента с ионогенными и неионогенкыми сорбентами в динамических условиях. Впервые осуществлено концентрирование фермента гиалуронидазы из экстракта на макропористом сульфокатионите в ионообменных колонках. Показано, что выявленные закономерности полностью масштабируются и оіггимизируются с помощью критериального параметра к, что создает возможность осуществления крупномасштабного процесса ионообменого выделения фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота.
Практическое значение. На основе экспериментальных данных исследования был разработай патент "Способ получения гиалуронидазы". Способ апробирован в условиях цеха ферментных препаратов завода медицинских препаратов АО "Самсон" (Санкт-Петербург). Предлагаемый способ позволил сократить время технологического
процесса почти в 2 раза и улучшить качество ферментного препарата, а также условий труда.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Фермент гиалуронидаза из семенников крупного рогатого скота представляет собой
совокупность полимерных форм (серий) с различными молекулярными массами (10 -
200 кДа), обладающих одинаковой удельной активностью.
2. Концентрирование полимерных форм фермента пшгуронидазы из экстракта
семенников крупного рогатого скота возможно в равновесных условиях в процессе
сорбции-десорбции вместо традиционного метода с использованием органического
растворителя.
3. Очистка фермента возможна с применением фронтально-хроматорграфического процесса сорбции в неравновесных условиях ка макропористых иеионогенньк сорбентах.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:
Всероссийской научной конференции "Химия и технология лекарственных
веществ" (Санкт-Петербург, 1994);
Семинаре "Теория и практика ионного обмена, ионообменная хроматография",
Всероссийского химического общества им. Д.И. Менделеева (Спб, 1994)
10-ом Интернациональном симпозиуме "Advances and application of
chromatography і» industry" (Братислава, 1996) По теме диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, двух глав, содержащих материалы собственных исследований и
обсуждения результатов, приложения, заключения, выводов и списка литературы. Приложение включает в себя акт апробации и технологии получения фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота с использованием экстракции ионообменного выделения гиалуронидазы из экстракта с последующим осаждением сульфатом аммония. Часть материалов и результатов исследовательской работы по проекту "Фундаментальные и практические аспекты разделения биополимеров с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и капиллярного электрофореза (КЭ)" выполнены в Институте Хроматографии национального исследовательского центра Италии (Рим).