Введение к работе
Актуальность ^ проблемы. D-глицеральдегид-З-фосфат-
дегидрогеназа (ГАФД)* на протяжении многих лет является объектом интенсивного изучения. Этот фермент катализирует один из ключевых этапов гликолиза: реакцию окислительного фосфорилирования глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-дифосфоглицерат с образованием NADH. Для ГЛФД из различных источников известна первичная аминокислотная последовательность, для многих имеются данные рент-геноструктурного анализа. Все эти белки характеризуются высокой степенью гомологии и сходством четвертичной структуры. Фермент представляет собой тетрамер из 4-х химически идентичных субъединиц. Каталитический механизм реакции и структура фермента подробно охарактеризованы в многочисленных работах [Harris and Waters, 1976].
Вместе с тем, за последнее десятилетие появилось много данных о том, что роль ГЛФД в клетке не ограничивается участием в гликолизе. Оказалось, что фермент играет существенную роль в слиянии клеточных мембран и клеточной адгезии, экспорте тРНК, репликации ДНК, обладает фосфотрансферазной активностью. Имеются данные о том, что ГАФД вовлечена в развитие нейродегенеративных заболеваний и вирусных инфекций, а также непосредственно участвует в апоптозе. Кроме того, фермент является мишенью для воздействия клеточных окислителей; N0 и перекиси водорода. Эти важные биологические функции ГАФД в значительной степени определяются особенностями внутриклеточной локализации и олигомерной структуры фермента in vivo [Sirover, 1999]. Поэтому, для исследователя представляется очень важной возможность получения "инструмента", который мог бы различать олигомерные состояния ГАФД ык in vitro, так и in vivo. Таким "инструментом" могут быть моноклональные антитела, специфичные к определенной форме белка.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось получение моноклональных антител, специфичных к ненатнвным формам ГАФД, характеристика их взаимодействия с различными олигомерными фор-
Список сокращений: БСА - бычий сывороточный альбумин; ГАФД - D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа; ГАФДк - D-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из мышц кролика; ГАФДв51 -D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа из Bacillus stearothermo-philus; ДСН - додецилсульфат натрия; 3-ФГА - D-глицеральдегид-З-фосфат ФМСФ - фенилметансульфонилфторид; ELISA - твердофазный иммуноферментый анализ, Ig - иммуноглобулины; mAbs -моноклональные антитела.
мами антигена, изучение влияния на ферментативную активность, а также получение данных о свойствах антигенной детерминанты, взаимодействующей с антителами.
Научная новизна работы. После иммунизации мышей препаратом нативной ГАФДк были получены два клона антител (mAbs 6С5 и mAbs 6G7), специфичных к ненативым формам ГАФДк- С помощью методов иммуноферментного анализа, гель-фильтрации, иммобилизации одного из партнеров реакции показано, что полученные антитела взаимодействуют с дилерами, мономерами и денатурированными формами ГАФД из мышц кролика, но не с нативными тетрамерами антигена. Впервые для выявления специфичности mAbs использован метод иммобилизации на сефарозе различных форм антигена. Установлено, что взаимодействие с антителами не влияет на ферментативную активность ГАФДк, но блокирует ее спонтанную ренатурацию. Иммобилизованные антитела mAbs 6G7 использованы для очистки препаратов ГАФДк от денатурированных примесей. Обнаружено перекрестное взаимодействие антител клона 6С5 с денатурированными молекулами ГАФДз$і- В то же время, в отличие от реакции с исходным антигеном, антитела не связываются не только с тетрамерами, но и с димерами и мономерами ГАФДп,,. На основании полученных данных сделаны предположения о структуре и локализации антигенной детерминанты в молекуле ГАФД, взаимодействующей с антителами клона 6С5.
Практическое значение работы состоит в том, что полученные моноклональные антитела могут быть использованы для изучения олигомериого состояния ГАФД в процессе осуществления этим ферментом различных биологических функций. Кроме того, существенную практическую значимость имеют предложенные методы очистки препаратов фермента от денатурированных примесей, а также использования иммобилизованных олигомерных форм белков для выявления специфичности антител к различным состояниям антигена.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ, а также на Втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997 г.), на международной конференции "Biocatalysis-98. Fundamental and Applications" (Пущино-на-Оке, 1998 г), и на международном симпозиуме "Protein structure, stability and folding. Fundamental and Medical Aspects" (Москва, 1998).
Публикаиин. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов иссле-