Введение к работе
Актуальность темы: Возрастающая потребность в оценке влияния химических соединений на здоровье человека делает весьма актуальной задачу исследования ферментных систем, вовлеченных в биотрансформацию поступающих в организм ксенобиотиков. Функции инактивации химических веществ и метаболической активации через формирование из ксенобиотиков более реактивных продуктов несет на себе монооксигеназная система, локализованная в мембранах зндоплазматического ре-тикулума клеток печени и других тканей. Проблемы токсифика-ции находятся в центре внимания, так как реактивные метаболиты инициируют репродуктивные аномалии, иммунопатологии, тератогенные и канцерогенные эффекты в тканах.
С проблемами токсификации тесно связаны эффекты индукторов MX-типа ( полициклические ароматические углеводороды, полихлорированные бифенилы, нафтофлавоны ) и индуцируемые ими активности цитохромов P-450IA1 и P-450IA2 ( Nebert et al., 1987 ). Традиционным подходом в изучении роли форм ци-тохрома Р-450 в процессах биотрансформации ксенобиотиков является исследование гемопротеидов в изолированном из мик-росомальной мембраны состоянии. Это позволяет установить функциональные характеристики ферментов, охарактеризовать их физико-химические свойства и оценить вклад различных форм цитохрома Р-450 в метаболические процессы, происходящие в тканях.
На сегодняшний день достаточно полно охарактеризованы изолированные цитохромы семейства P-450I из печени крыс индуцированных ПАУ ( Guengerich et al., 1982, Ryan et al. , 1980, Kuwahara et al. ,1984, Гуляева и др. 1985 ). Это позволило ряду авторов применить полученные функциональные характеристики изолированных .цитохромов P-450IA1 и P-450IA2 крыс для экстрополяции ряда параметров на процессы, катализируемые .монооксигеназной системой печени человека. В то же время не был проведен сравнительный анализ характеристик гомологичных форм цитохромов семейства P-450I и их функционирования в микросомной монооксигеназной системе у различных видов животных. Важность подобного анализа обус-
- 4 -ловлена, во-первых, необходимостью подбора корректной модельной системы на животных, позволяющей экстраполировать полученные данные на функционирование цитохромов семейства Р-450І в печени человека. Во-вторых, это важно для оценки участия гомологичных ПАУ-индуцируемых форм цитохрома Р-450 в процессах токсификации у различных видов животных.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было получение форм цитохрома семейства Р-450І из печени мышей, индуцированных 3,4-бензпиреном, характеристика физико-химических и каталитических свойств изолированных ферментов, проведение сравнительного анализа полученных и имеющихся в литературе данных для гомологичных цитохромов семейства Р-450І крыс и мышей, а также выяснение роли этих форм гемопротеида в химически инициируемом канцерогенезе.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
а) разработать методы хроматографической очистки форм
цитохрома Р-450 из печени ПАУ-индуцированных мышей и полу
чить изолированные ферменты;
б) изучить физико-химические и каталитические свойства
изолированных цитохромов Р1-450 и РЗ-450;
в) провести сравнительный анализ физико-химических и
каталитических свойств изолированных цитохромов Р-450ІА1 и
Р-450ІА2 из печени крыс и мышей;
г) на основании иммуноингибиторного анализа оценить
вклад цитохромов Р-450ІА1 и Р-450ІА2 крыс и мышей в метабо
лизм таких специфических субстратов, как 7-этоксирезоруфин
(7-ЭР) и 3,4-бензпирен (БП) в микросомах печени индуциро-.
ванных животных;
д) оценить количество цитохромов семейства Р-450І в
микросомах печени мышей и их метаболическую активность при
длительном введении БП..
Научная новизна работы. В работе предложена оригинальная процедура хроматографической очистки форм цитохрома семейства Р-450І из печени БП-индуцированных мышей в гомогенном состоянии, позволяющая получать изолированный цитохром РЗ-450 без потери им метаболической активности. - .В работе впервые определены каталитическая активность и спектральные свойства изолированных цитохромов Р1-450 и РЗ-450.
С помощью иммуноингиоиторного анализа впервые показана разная субстратная специфичность гомологичных форм цитохро-мов Р-4501ЛІ (Р1-450 и Р-450с) и P-450IA2 ( РЗ-450 И P-450d) крыс и мышей, соответственно.
Практическая значимость. Работа представляет собой экспериментальное исследование физико-химических и каталитических свойств изолированных и микросомальных форм цитохро-ма семейства Р-4Б0І мышей и носит преимущественно теоретический характер. Значимость ее заключается в получении новых фактов о субстратной специфичности гомологичных форм цитохрома P-450IA1 и P-450IA2 крыс и мышей по отношению к 7-ЭР и ЕЕ Проведенный сравнительный анализ характеристик каталитической активности гомологичных цитохромов семейства P-450I крыс и мышей имеет значение при решении вопроса о возможности использования грызунов как "модельной" системы отражающей процессы биотрансформации ксенобиотиков у человека.
Разработанный метод получения каталитически активных форм цитохрома Р-450 из печени ПАУ-индуцированных мышей в настоящее время используется в лабораториях СО АМН СССР при изучении микросомной монооксигеназной системы.
Работа выполнена в рамках Всесоюзной программы "Гид-роксилаза" в соответствии с плановой темой, утвержденной Государственным комитетом СССР по науке и технике ( N государственной регистрации 79040821 ).
Апробация работы. Материалы диссертации были' представлены на III Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды" ( Новосибсрск, 1987 ), на II Международном симпозиуме "Ферментные системы и метаболизм химических веществ" ( Болгария, 1989 J, на III Европейском симпозиуме "Метаболизм чужеродных соединений" ( Лондон,198S )
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 145 страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части: описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы из 186 наименований, содержит 4 таблицы и 16 рисунков.