Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время установлена важная роль протео-литических ферментов в регуляции всех процессов жизнидеятельности. Исследование функций протеиназ в норме и патологии является одной из актуальных задач медицинской биохимии.
В последние годы большое внимание уделяется гранулоцитарным протеиназам, в частности эластазе и катепсину G, которые могут освобождаться из нейтрофильных лейкоцитов при воспалительных процессах {Ерюхин и др., 1989, Маянский и Маян-ский, 1989; Barrett ef al, 1977; Bond & Batter, 1987). Известно, что эти ферменты, особенно эластаза, могут гидролиэовать многие белки различных тканей и плазмы кропи {Bieth, 1978; Fritz, 1980; Jochum et a/., 198S), вызывая развитие тяжелых патологических состояний, таких как острое и хроническое воспаление, шок, тромбогеморрагия и pp.(Uehara etal., 1992, Sandsmo et al., 1983; Heem, 1992).
Особый интерес представляет изучение взаимодействия гранулоцитарных протеиназ с протеолитическими системами плазмы крови (гемокоагулирующая, фибрино-литическая, калликреин-кининовая, ангиотензин-рениновая, система комплемен-та),обеспечивающими процессы адаптации и защиты. В соответствии с современными представлениями, центральное место в регуляции активности всех протеолитических систем плазмы крови занимает калликреин-кининовая система. Изучение состояния этой системы при патологических состояниях необходимо для понимания процессов регуляции протеолитических систем плазмы крови. Известно, что пусковым механизмом активации протеолитических систем плазмы крови являются процессы взаимоактивации прекалликреина и фактора Хагемана с участием калликреина и высокомолекулярного кининогена (Revak etal., 1978; Kaplan etal., 1987; Schmaier et al., 1987; Heem, 1992).
Однако, практически неизученным остается вопрос о влиянии протеолитических ферментов клеток крови, в частности, нейтрофильных лейкоцитов, участвующих в развитии воспалительной реакции организма, на калликреин-кининовукэ систему, что приводит к возникновению гемодинамичесих сдвигов , вплоть до развития дис-семилированного внутрисосудистого свертывания.
Цель работы. Целью настоящего исследования явилось изучение действия лейкоцитарных протеиназ (эластазы и катепсина G) на ключевые компоненты каллик-реин-кининовой системы: прекалликреин, фактор Хагемана (XII фактор светывания
крови) и их активные формы, а так же разработка нового варианта спектрофотомет-
I рического метода определения активности лейкоцитарной зластазы.
| Задачи работы. В соответствии с поставленной целью были определены следующие конкретные задачи:
-
Выделить эластазу из полиморфноядерных лейкоцитов методом биоспецифической хроматографии и охарактеризовать физико-химические и энзиматические свойства полученного фермента.
-
Получить методом аффинной хроматографии кателсин G из лейкоцитов человека и охарактеризовать его физико-химические и энзиматические свойства.
-
Исследовать действие лейкоцитарных эластазы и катепсина G на прекалликреин, фактор Хагемана и их активные формы.
-
Разработать метод определения активности эластазы, находящейся в комплек-
се с сИ-протеиназным ингибитором. I Научная новизна. Показано, что высокоочищенные препараты лейкоцитарных
протеиназ (эластаза и катепсин G) инактивируют ключевые факторы контактной активации протеолитических систем плазмы крови - калликреин, активный фактор Хагемана и их проферменты. Впервые продемонстрирована возможность определения активности лейкоцитарной эластазы в комплексе с а1-протеиназным ингибитором. Научно-практическое значение. Впервые выявлена роль протеиназ в регуляции активности калликреин-кининовой и гемокоагулирующей систем плазмы крови. Предложен вариант быстрого и эффективного метода очистки лейкоцитарных эластазы и катепсина G, позволяющий получать лейкоцитарные ферменты в высокоочи-щенном виде и препаративных количествах. Разработан метод определения активности эластазы в комплексе с а1-протеиназным ингибитором в плазме крови.Метод позволяет оценить интенсивность дегрануляционных процессов в нейтрофилах in vivo при патологических состояниях, связанных с воспалением. Высокая активность лейкоцитарной эластазы в плазме крови больного может служить показателем при прогнозировании осложнений течения воспалительных процессов.
Положения, выносимые на защиту.
V Исследование действия эластазы и катепсина G на фактор Хагемана, прекал-ликреин и их активные формы осуществлено с помощью высокоочищэнных препаратов лейкоцитарных ферментов, выделенных с помощью биоспецифической хроматографии на гордокс-сефарозе, из одной порции лейкоцитарной массы. Характеристика энзиматических и физико-химических свойств препаратов гранулоцитарных сериновых протеиназ: эластазы и катепсина G.
2.Лейкоцитарная эластаза оказывает выраженное инактивирующее действие на ключевые ферменты калликреин-кининовой системы - фактор Хагемана, калликреин и их предшественники.
-
Лекоцитарный катепсин G инактивирует фактор Хагемана и его активную форму , оставляя интактными молекулы калликреина и прекалликреина.
-
Для определения степени дегрануляционной активности нейтрофилов и уровня эластаэы в русле крови разработан спектрофотометрический метод определения активности эластазы, связанной с «1-протеинаэным ингибитором.
Апробация работы.
Материалы диссертации были доложены на VIII Международной конференции по протеолиэу (Германия, 1990 г.), на III Международном симпозиуме по ингибиторам и биологическому контролю (Югославия, 1991 г.), на III симпозиуме "Химия протеоли-тических ферментов" (Москва, 1993 г.), на международной конференции "Кинины'ЗЗ", (Бразилия, Сан-Пауло, 1993 г.).
Структура и объем работы.